miR-140-3p通過靶向PD-L1抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的活力、遷移和侵襲*

張宇軒， 李春偉， 毛文浩， 朱恪巖， 邵揚(yáng)謙， 鄧曉明△

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1中西醫(yī)結(jié)合科， 2腫瘤科， 河南 鄭州 450052; 3河南省腫瘤醫(yī)院甲狀腺頭頸外科， 河南 鄭州 450008)

非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌的80%～85%左右，由于其早期癥狀不明顯，患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已處于晚期[1-2]。目前，針對NSCLC的主要治療手段為手術(shù)、化療和放療[3-4]。然而與小細(xì)胞肺癌相比，NSCLC具有對放療和化療相對不敏感的特點(diǎn)，盡管極大程度地發(fā)展放化療手段，患者5年存活率仍低于15%[5]。因此，需要大力推進(jìn)相關(guān)科學(xué)研究以提高對NSCLC的診斷以及治療水平。

微小RNA(microRNA,miRNA，miR)是一種長度大約為22 nt的小分子單鏈非編碼RNA，可與下游靶基因mRNA的3’-UTR結(jié)合，從而促進(jìn)其發(fā)生降解或者抑制翻譯過程[6]。隨著對miRNA的深入研究，人們提出miRNA的異常表達(dá)模式可被作為具有特異性的臨床診斷和治療預(yù)后生物標(biāo)志物[7]。除此之外，miRNA還可以通過對靶基因的調(diào)控而影響致癌基因或腫瘤抑制因子的活性，與腫瘤的發(fā)生進(jìn)程息息相關(guān)[8]。文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-140-3p在多種腫瘤中呈現(xiàn)低表達(dá)的現(xiàn)象，在肺癌組織中同樣表達(dá)下調(diào)[9-10]。程序性細(xì)胞死亡配體1(programmed cell death ligand 1，PD-L1)與機(jī)體免疫應(yīng)答息息相關(guān)，在腫瘤免疫逃逸中扮演著重要角色。因此，本研究將探討miR-140-3p和PD-L1對NSCLC細(xì)胞活力、遷移和侵襲的影響及其具體作用機(jī)制，為后續(xù)研究NSCLC的診斷及治療提供科學(xué)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

人胚肺成纖維細(xì)胞HLF-1及肺癌細(xì)胞A549和H1299購自北京北納生物。pcDNA3.0質(zhì)粒購自淼靈生物；BCA定量、RNA提取和反轉(zhuǎn)試劑盒購自Thermo；TB Green定量試劑購自TaKaRa；胎牛血清和0.25%胰蛋白酶購自Gibco；MTT試劑盒購自上海歌凡生物；兔抗PD-L1和GAPDH單抗購自Abcam；HRP標(biāo)記的羊抗兔 II 抗購自Cell Signaling Technology；Lipofectamine 2000 購自Invitrogen；Transwell小室購自Corning；miR-140-3p模擬物(mimic)和抑制劑(inhibitor)購自上海吉瑪生物；引物由上海生工合成。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)于5% CO2、90%相對濕度的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，細(xì)胞貼合度為70%～80%使用0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。

2.2RT-qPCR檢測細(xì)胞內(nèi)miR-140-3p和PD-L1的表達(dá)水平 取生長狀態(tài)良好的HLF-1、A549和H1299細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-qPCR法檢測miR-140-3p和PD-LI mRNA的表達(dá)水平。PD-L1上游引物序列為5’-TGACGAGCACACTGAGAA-3’,下游引物序列為5’-AAGGC-AGAATAAGATGGC-3’; GAPDH的上游引物序列為5’-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3’，下游引物序列為5’-GGGGTCATTGATAACAACAATA-3’；U6的上游引物序列為 5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引物序列為5’-CGCTT CACGAATTTGCGTGTCAT-3’; miR-140-3p的上游引物序列為5’-ACACTCCAGCTGGGAGGC-3’，下游引物序列為5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’。以采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-140-3p的表達(dá)水平。

2.3脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將A549細(xì)胞按每孔2×105個(gè)接種于6孔板，過夜貼壁后，按照Lipofectamine 2000操作說明書轉(zhuǎn)染miR-140-3p mimic、miR-140-3p inhibrtor及相應(yīng)的mimic control和inhi-bitor control，培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)構(gòu)建過表達(dá)PD-L1的pcDNA3.1質(zhì)粒，利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PD-L1及對照空載質(zhì)粒。

2.4雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 以健康人DNA為模板，PCR擴(kuò)增miR-140-3p與PD-L1結(jié)合區(qū)域WT-3’-UTR和PD-L1-MUT-3’-UTR的DNA片段,將PCR產(chǎn)物分別與pMIR-REPORT luciferase報(bào)告載體分別用SpeⅠ和HindⅢ雙酶切后純化，連接，轉(zhuǎn)化，鑒定，獲得PD-L1的含WT-3’-UTR以及MUT-3’-UTR螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒。將其分別與miR-140-3p模擬物或抑制劑共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48 h，使用Promega公司雙螢光素酶活性檢測試劑盒按說明書在單光子檢測儀中檢測細(xì)胞螢光素酶活性。相對螢光素酶活性=螢火蟲螢光素酶活性值/海腎螢光素酶活性值。

2.5Western blot分析 收集轉(zhuǎn)染miR-140-3p模擬物和抑制劑的A549細(xì)胞，加入裂解液在低溫條件下反應(yīng)1 h，之后12 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞上清液，使用BCA法檢測上清總蛋白濃度。加入5×loading buffer，沸水處理10 min，每個(gè)點(diǎn)樣孔中加入50 μg蛋白，90 V電泳30 min，120 V繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)條帶遷移至底部。100 V、低溫轉(zhuǎn)膜45 min，使用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入1∶1 000稀釋比例的 I 抗4 ℃封閉過夜，加入1∶5 000濃度的 II 抗室溫反應(yīng)2 h，DAB法進(jìn)行顯色反應(yīng)，并對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

2.6MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力 取分別轉(zhuǎn)染了miR-140-3p模擬物和pcDNA3.0-PD-L1質(zhì)粒的A549細(xì)胞單懸液，按照每孔5×104個(gè)的密度接種于96孔板中，37 ℃培養(yǎng)24 h后加入20 μL 5 g/L的MTT，37 ℃孵育4 h。去除上清，加入150 μL DMSO溶液避光反應(yīng)10 min，使用酶標(biāo)儀于490 nm處檢測吸光度(A)值。

2.7Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力 取轉(zhuǎn)染miR-140-3p模擬物和pcDNA3.0-PD-L1質(zhì)粒48 h后的A549細(xì)胞單懸液，加入無血清培養(yǎng)基后按照每孔5×103個(gè)的密度接種于上層腔室，在下層培養(yǎng)基中加入含有10%的胎牛血清的培養(yǎng)基。37 ℃孵育培養(yǎng)24 h后，使用棉簽從上層腔室中轉(zhuǎn)移未發(fā)生遷移和侵襲的細(xì)胞，其余細(xì)胞從下層腔室轉(zhuǎn)移。之后，將得到的細(xì)胞使用0.1%的結(jié)晶紫染液染色30 min，PBS沖洗3次后使用33%乙酸低溫孵育10 min，測量570 nm處的吸光度值并計(jì)算遷移細(xì)胞個(gè)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)在上層腔室加入無血清培養(yǎng)基稀釋過的終濃度為1 g/L的基質(zhì)膠100 μL，置于37℃培養(yǎng)箱中待其凝固，后續(xù)操作同遷移實(shí)驗(yàn)。每組3個(gè)重復(fù)，與miRNA對照組相比較，計(jì)算細(xì)胞相對數(shù)值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件分析處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較使用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-140-3p在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中低表達(dá)

RT-qPCR檢測了HLF-1、A549和H1299細(xì)胞中miR-140-3p的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與HLF-1細(xì)胞相比，非小細(xì)胞癌A549和H1299細(xì)胞中miR-140-3p表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖1。因此后續(xù)研究選擇A549細(xì)胞作為研究對象。

Figure 1. The expression of miR-140-3p in different cell lines detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHLF-1.

圖1RT-qPCR檢測miR-140-3p在不同細(xì)胞系的表達(dá)情況

2 miR-140-3p靶向調(diào)控PD-L1

在線軟件TargetScan分析發(fā)現(xiàn)PD-L1是miR-140-3p的潛在靶標(biāo)，見圖2A。為驗(yàn)證兩者之間的靶向調(diào)控關(guān)系，本研究進(jìn)行了雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)并使用Western blot檢測了miR-140-3p對PD-L1蛋白表達(dá)的影響。將miR-140-3p模擬物或抑制劑與PD-L1 WT-3’-UTR或MUT-3’-UTR共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，36 h后檢測細(xì)胞的相對螢光素酶活性。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染miR-140-3p模擬物和PD-L1 MUT-3’-UTR組相比，轉(zhuǎn)染miR-140-3p模擬物和PD-L1 WT-3’-UTR的螢光素酶活性顯著下調(diào)(P<0.05)；與轉(zhuǎn)染miR-140-3p抑制劑和PD-L1 MUT-3’-UTR組相比，轉(zhuǎn)染miR-140-3p抑制劑和PD-L1 WT-3’-UTR的螢光素酶活性顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖2B。Wes-tern blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-140-3p模擬物后，A549細(xì)胞內(nèi)PD-L1的表達(dá)水平顯著下調(diào)；轉(zhuǎn)染miR-140-3p抑制劑后，PD-L1表達(dá)量顯著回升(P<0.05)，見圖2C。以上實(shí)驗(yàn)表明，PD-L1基因受到miR-140-3p的靶向負(fù)調(diào)控作用。

3 過表達(dá)miR-140-3p抑制A549細(xì)胞的活力

將miR-140-3p模擬物轉(zhuǎn)染進(jìn)入A549細(xì)胞，RT-qPCR檢測miR-140-3p模擬物效率，MTT法檢測其對細(xì)胞活力的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-140-3p模擬物組miR-140-3p相對表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖3A；并且miR-140-3p表達(dá)量的提高對A549細(xì)胞的生長具有抑制作用(P<0.05)，見圖3B。

4 過表達(dá)miR-140-3p抑制A549細(xì)胞遷移和侵襲

A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-140-3p后，Transwell法檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。與轉(zhuǎn)染對照組相比，miR-140-3p模擬物組的細(xì)胞遷移和侵襲個(gè)數(shù)均顯著降低(P<0.05)，由此可見，A459細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)miR-140-3p能夠顯著抑制遷移和侵襲能力，見圖4。

5 PD-L1阻斷miR-140-3p對A549細(xì)胞的抑制

為明確miR-140-3p和PD-L1的具體作用機(jī)制以及對A549細(xì)胞的影響，將pcDNA3.0-PD-L1質(zhì)粒與miR-140-3p mimic共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，用MTT法檢測其對細(xì)胞活力的影響，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-140-3p mimic組和miR-140-3p mimic+vector組相比，miR-140-3p mimic+pcDNA3.0-PD-L1組的細(xì)胞遷移和侵襲個(gè)數(shù)均明顯增多(P<0.05)，見圖5A。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-140-3p mimic組相比，pcDNA3.0-PD-L1和miR-140-3p mimic共轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞活力得到提高(P<0.05)，見圖5B。以上結(jié)果說明了過表達(dá)PD-L1能夠阻斷miR-140-3p對A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。

Figure 2.Verification of the target relationship between miR-140-3p and PD-L1.A: TargetScan software prediction; B: dual-lucife-rase receptor assay comfirmed the target relationship; C: Western blot was performed to detect the protein level of PD-L1. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmimic control group;#P<0.05vsinhibitor control group.

圖2miR-140-3p與PD-L1靶向關(guān)系的驗(yàn)證

Figure 3.The effect of over-expression of miR-140-3p on the viability of A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmimic control group.

圖3過表達(dá)miR-140-3p對A549細(xì)胞活力的影響

Figure 4.The effects of miR-140-3p over-expression on the migration (A) and invasion (B) abilities of A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmimic control group.

圖4過表達(dá)miR-140-3p對A549細(xì)胞遷移和侵襲的影響

討 論

肺癌是常見致死腫瘤之一，其在我國的發(fā)病率和致死率均居首位，對國民健康有著巨大威脅[2,11]。非小細(xì)胞肺癌占肺癌總類型的80%以上，主要病理組織類型為腺癌和鱗癌[12]。目前，因發(fā)病的隱蔽性，大部分就診患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬晚期，治療效果和預(yù)后差，5年生存率極低，因此急需提出一種新的治療手段提高患者生存率[13]。近些年來，關(guān)于腫瘤的免疫治療相關(guān)科學(xué)研究取得了巨大進(jìn)步，研究者發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)不僅能夠參與監(jiān)管和清除腫瘤細(xì)胞，而且在特定的階段還能夠促進(jìn)腫瘤發(fā)生免疫逃逸，因此在機(jī)體腫瘤發(fā)生進(jìn)程扮演重要角色[14]。

PD-1是B7-CD28免疫球蛋白家族成員之一，在活化的CD4+T、CD8+T和B細(xì)胞等均有表達(dá)，與機(jī)體的免疫應(yīng)答息息相關(guān)[9, 15-16]。正常情況下，效應(yīng)T細(xì)胞的活化需要TCR和APC表面的共刺激分子結(jié)合，而此時(shí)機(jī)體內(nèi)的共刺激分子和共抑制分子的水平保持在一定的平衡穩(wěn)態(tài)，從而使T細(xì)胞的免疫功能維持在恰當(dāng)?shù)乃剑饶茏钃蹩乖那趾τ帜軠p少對機(jī)體自身的組織損傷。然而，腫瘤可通過異常的代謝調(diào)控共抑制分子和相關(guān)配體的表達(dá)活性，例如PD-1的配體PD-L1和PD-L2，從而抑制T細(xì)胞的免疫功能，造成腫瘤對免疫系統(tǒng)監(jiān)管的躲避，導(dǎo)致并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[15, 17-19]。研究表明，PD-L1在多種惡性腫瘤中均出現(xiàn)高表達(dá)[20-22]，另外PD-L1 作為單獨(dú)的靶點(diǎn)，其表達(dá)水平高低與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性以及腫瘤的預(yù)后存在相關(guān)性[23]。Thompson等[24]通過對196腎癌腫瘤組織樣品分析發(fā)現(xiàn)，PD-L1的上調(diào)表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移能力并且能夠提高4.5倍的死亡風(fēng)險(xiǎn)。由此可見，PD-L1活性的抑制是阻礙腫瘤發(fā)生免疫逃避的重要手段之一。

大量研究表明miRNA參與細(xì)胞分化、生長和凋亡等多種生物學(xué)過程[25]，其中miR-140-3p被報(bào)道在多種癌癥中均出現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，包括非小細(xì)胞肺癌[26-28]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-140-3p在肺癌A549和H1299細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)，與上訴文獻(xiàn)報(bào)道一致。通過TargetScan分析發(fā)現(xiàn)，PD-L1是miR-140-3p的潛在靶標(biāo)，并且雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)了靶向關(guān)系。將miR-140-3p模擬物轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，PD-L1表達(dá)下調(diào)，對細(xì)胞活力和遷移侵襲能力具有抑制作用；將miR-140-3p模擬物和pcDNA3.0-PD-L1共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，miR-14-3p對細(xì)胞活力和遷移侵襲能力的抑制作用得到解除，表明PD-L1能夠阻斷miR-140-3p對A549細(xì)胞的抑制。

綜上所述，miR-140-3p和PD-L1的異常表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌有著重要聯(lián)系，本研究主要探討了兩者之間的作用關(guān)系以及在非小細(xì)胞肺癌中的作用機(jī)制，并證實(shí)了miR-140-3p可通過靶向PD-L1抑制A549細(xì)胞活力、遷移和侵襲。然而，本研究雖然從生物學(xué)現(xiàn)象上揭示了腫瘤細(xì)胞微環(huán)境下PD-L1對A549細(xì)胞遷移侵襲的影響和作用，為PD-L1靶點(diǎn)治療提供理論支持，但是關(guān)于PD-L1的參與遷移侵襲具體機(jī)制尚不清楚，仍需進(jìn)一步深入研究。

Figure 5.The effects of PD-L1 over-expression on the viability, migration and invasion of A549 cells. A: the migration and invasion abilities were detected by Transwell assay; B: the cell viability was detected by MTT assoy. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-140-3p mimic group;#P<0.05vsmiR-140-3p+vector group.

圖5過表達(dá)PD-L1對A549細(xì)胞活力、遷移和侵襲的影響