羅肖肖， 張 暢， 趙 蕾△， 王 燕， 2△

(1重慶醫(yī)科大學(xué)脂糖代謝性疾病重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 重慶 400016； 2重慶市璧山區(qū)人民醫(yī)院， 重慶 402760)

慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)可導(dǎo)致不可逆的腎功能的逐漸喪失，是非常重要的全球性公共衛(wèi)生問題。CKD被認(rèn)為是炎癥狀態(tài)，在CKD的發(fā)生和發(fā)展中慢性炎癥和氧化應(yīng)激起著關(guān)鍵作用[1]。目前的大量流行病學(xué)資料顯示,CKD患者體內(nèi)促炎細(xì)胞因子顯著升高，且其體內(nèi)增加的血清炎癥因子，如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6, IL-6)和血清淀粉樣蛋白A(serum amyloid A， SAA)等，與預(yù)后不良或終末期腎病患者的死亡率呈正相關(guān)[1-4]。

CD36屬于B類清道夫受體家族，能識(shí)別多種外源性和內(nèi)源性的有害物質(zhì)，如氧化性低密度脂蛋白和β淀粉樣蛋白等，在動(dòng)脈粥樣硬化和阿茲海默氏病的病變過程中起到非常重要的作用[5-6]。CD36與CKD的發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān)，既往研究表明糖尿病腎病患者的腎臟組織內(nèi)CD36表達(dá)明顯增加，而且抑制CD36可以減輕小鼠腎臟纖維化[7-8]。但目前尚不清楚炎癥應(yīng)激對(duì)小鼠腎臟組織CD36表達(dá)的影響，及其在腎臟損傷中的作用。因此本研究擬應(yīng)用酪蛋白(casein)注射小鼠，誘導(dǎo)慢性炎癥模型，觀察炎癥應(yīng)激是否通過影響CD36表達(dá)參與慢性腎臟損傷。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

C57BL/6J小鼠購自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心,許可證號(hào)為SYXK(渝)2012-0001。CD36 基因敲除(CD36 knockout, CD36KO)小鼠由美國Maria Febbraio教授惠贈(zèng)。

2 主要試劑

高脂飼料(D12109C)購自Research Diets；TRIzol RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix均購自TaKaRa；細(xì)胞總蛋白提取試劑盒購自凱基公司；BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒購于北京鼎國公司；TNF-α蛋白ELISA試劑盒購自華美生物公司；蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色試劑盒和過氧化氫檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天公司；Masson染色試劑盒購自北京索萊寶公司；抗CD36抗體購自NOVUS；抗TNF-α抗體購自Proteintech；抗β-肌動(dòng)蛋白 (β-actin)抗體、II抗及DAB顯色液購自北京中杉金橋公司；抗轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)抗體購自Santa；抗Nrf2抗體購自北京博奧森公司；PVDF膜購于Millipore；ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自Bio-Rad；引物由北京六合華大基因公司合成。

3 主要方法

3.1動(dòng)物選擇與分組 將8周齡雄性C57BL/6J和CD36KO小鼠隨機(jī)分為C57BL/6J生理鹽水注射組、C57BL/6J酪蛋白注射組和CD36KO酪蛋白注射組，每組8只，隔日注射，各組小鼠均給予高脂飼料喂養(yǎng)，處理14周。

3.2Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 小鼠處理14周后，4%水合氯醛麻醉，剖腹取腎，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂迷噭┖刑崛∧I組織總蛋白，12 000 ×g、4 ℃離心15 min，吸取上清液，用BCA法進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)。取50～100 μg蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白，PVDF膜轉(zhuǎn)膜后，室溫封閉1 h，將膜用I抗(抗TNF-α、抗CD36和抗β-actin抗體)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次15 min,然后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗室溫下孵育1 h，TBST清洗2次，每次15 min,最后用TBS洗滌1次，利用化學(xué)發(fā)光劑ECL顯色曝光，采用ImageJ軟件對(duì)條帶的強(qiáng)度(灰度×面積)進(jìn)行定量分析。

3.3Real-time PCR檢測(cè)mRNA表達(dá) 使用TRIzol提取腎組織總RNA并檢測(cè)其含量和純度。將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件為 37 ℃ 5 min、85 ℃ 5 s、4 ℃ 5 min后終止，反應(yīng)產(chǎn)物置于-20 ℃保存。取2 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行real-time PCR，以β-actin為內(nèi)參照，反應(yīng)體系為25 μL。擴(kuò)增條件為:94 ℃預(yù)變性1 min; 94 ℃變性10 s、54 ℃退火10 s、72 ℃延伸10 s，進(jìn)行39個(gè)循環(huán)。記錄每個(gè)標(biāo)本和內(nèi)參照的Ct值，以2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的表達(dá)水平，引物序列見表1。

3.4組織病理HE染色 小鼠腎石蠟組織切片脫蠟后，蘇木素染色5 min，自來水沖洗10 min，伊紅染色2 min，脫水、透明、封片。

3.5組織病理Masson染色 按照試劑盒說明書，小鼠腎石蠟組織切片脫蠟后，Bouin液37 ℃煤染2 h，天青石藍(lán)染液2 min，Mayer蘇木素染液2 min，酸性乙醇分化數(shù)秒，麗春紅品紅染液10 min，磷鉬酸10 min，苯胺藍(lán)染液5 min，弱酸溶液2 min，脫水、透明、封片。膠原纖維被染成藍(lán)色。

表1 Real-time PCR引物序列

3.6血、尿腎功能檢測(cè) 小鼠處理14周后，收集24 h尿液，用4%水合氯醛麻醉后心臟采血，待血液完全凝固后，2 000×g、室溫離心10 min，吸取上清放-80 ℃保存?zhèn)溆?，使用全自?dòng)生化儀測(cè)定血、尿腎功指標(biāo)。

3.7ELISA實(shí)驗(yàn) 按照ELISA試劑盒說明書，運(yùn)用抗原抗體結(jié)合原理，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血清中TNF-α含量。

3.8過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)含量的分析 使用H2O2分析試劑盒測(cè)量腎臟組織中H2O2的水平。組織在裂解試劑中勻漿裂解， 12 000×g、 4 ℃離心5 min，取上清液與反應(yīng)試劑在室溫下反應(yīng)30 min，然后，在酶標(biāo)儀(BioTek)中讀取560 nm處的吸光度(A)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算H2O2含量。并將該沉淀收集到0.2 mol/L NaOH中，用于蛋白質(zhì)的標(biāo)化。

3.9免疫組織化學(xué)染色 按照試劑盒說明書，小鼠腎石蠟組織切片常規(guī)脫蠟至水，采用兩步法檢測(cè)Nrf2和TGF-β1的蛋白表達(dá)，DAB顯色。抗Nrf2抗體濃度1∶100，抗TGF-β1抗體濃度1∶50。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 酪蛋白注射誘導(dǎo) C57BL/6J小鼠慢性炎癥反應(yīng)

用0.5 mL濃度為10% 的酪蛋白隔日皮下注射C57BL/6J小鼠14周后，小鼠血清和腎臟組織的腫瘤壞死因子含量較等量生理鹽水處理的C57組顯著增加(P<0.05),見圖1、2。同時(shí)，real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)酪蛋白注射的C57BL/6J小鼠腎組織炎癥相關(guān)基因表達(dá)顯著高于生理鹽水組(P<0.05),見圖3。

Figure 1.The effect of 10% casein injection on serum contents of TNF-α in C57BL/6J mice. Mean±SEM.n=8.*P<0.05vsC57 group.

圖1酪蛋白注射對(duì)C57BL/6J小鼠血清TNF-α含量的影響

Figure 2.The protein expression of TNF-α in the renal tissues of C57BL/6J mice after 10% casein injection. Mean±SEM.n=4.*P<0.05vsC57 group.

圖2酪蛋白注射對(duì)C57BL/6J小鼠腎組織TNF-α含量的影響

Figure 3.The mRNA expression of inflammatory cytokines in the renal tissues of C57BL/6J mice after 10% casein injection. Mean±SEM.n=6.*P<0.05vsC57 group.

圖3酪蛋白注射對(duì)C57BL/6J小鼠腎臟炎癥因子表達(dá)的影響

2 酪蛋白注射促進(jìn)C57BL/6J小鼠腎組織CD36蛋白表達(dá)

酪蛋白隔日注射C57BL/6J小鼠14周后，收集腎組織樣本，用Western blot檢測(cè)C57BL/6J小鼠腎組織CD36蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，與C57 組相比，酪蛋白注射可以使C57BL/6J小鼠腎組織內(nèi)的CD36蛋白表達(dá)升高(P<0.05),見圖4。

3 CD36基因缺失改善酪蛋白注射誘導(dǎo)的小鼠腎損傷

通過HE 和Masson染色觀察小鼠腎組織形態(tài)，結(jié)果顯示, C57組小鼠的腎臟形態(tài)基本正常；與C57組相比，酪蛋白皮下注射后，C57+casein組小鼠腎小球血管袢間系膜增寬，基質(zhì)增生，部分毛細(xì)血管硬化萎縮，同時(shí)可以觀察到腎小球球囊擴(kuò)大；而與C57+casein組相比，CD36KO+casein組小鼠腎小球系膜區(qū)基質(zhì)增生明顯減少，腎間質(zhì)膠原纖維減少，毛細(xì)血管袢結(jié)構(gòu)較完整，見圖5。各組腎功能改變顯示，與C57組相比，C57+casein組血清肌酐(serum crea-tinine，SCr)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)及尿白蛋白排泄量(urinary albumin excretion，UAE)等均明顯升高(P<0.05)；與C57+casein組相比，CD36KO+casein組小鼠的Scr、BUN及UAE等均有改善(P<0.05)，見表2。以上結(jié)果說明CD36敲除可以改善酪蛋白對(duì)小鼠腎臟的損傷。

Figure 4.The protein expression of CD36 in the renal tissues of C57BL/6J mice after 10% casein injection. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vsC57 group.

圖4酪蛋白注射對(duì)C57BL/6J小鼠腎組織CD36蛋白表達(dá)的影響

4 CD36基因缺失減輕酪蛋白注射引起的小鼠腎組織氧化應(yīng)激

通過測(cè)量各組腎組織的H2O2含量來反映小鼠腎臟的氧化應(yīng)激水平，結(jié)果顯示，與C57組比較， C57+casein組小鼠腎組織 H2O2含量明顯增加(P<0.05)；與C57+casein組比較，CD36KO+casein組小鼠腎臟H2O2含量明顯減少(P<0.05)，見圖6。同時(shí)，通過免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組腎組織的Nrf2含量來反映小鼠腎臟抗氧化應(yīng)激能力，結(jié)果顯示,與C57組比較，酪蛋白注射降低小鼠腎臟Nrf2含量和抗氧化應(yīng)激能力，而CD36KO 能夠恢復(fù)小鼠腎臟Nrf2含量和抗氧化應(yīng)激能力，見圖7。以上結(jié)果說明CD36敲除可以減輕酪蛋白注射引起的小鼠腎臟組織氧化應(yīng)激。

5 CD36基因缺失通過降低TGF-β1保護(hù)酪蛋白注射引起的小鼠腎臟組織損傷

氧化應(yīng)激可以通過激活TGF-β1引發(fā)腎臟纖維化。使用免疫組化染色檢測(cè)C57BL/6J小鼠腎臟組織TGF-β1蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，與C57組相比，酪蛋白注射可以使C57BL/6J小鼠腎臟組織內(nèi)的TGF-β1蛋白表達(dá)升高而加重腎纖維化，而CD36KO能降低TGF-β1蛋白表達(dá)而緩解腎纖維化，見圖8。

Figure 5.Observation of the renal tissues by HE staining and Masson staining in each group.CD36 knockout alleviated the damage of mouse renal tissue structure caused by casein injection. The scale bar=50 μm.

圖5酪蛋白注射和CD36敲除對(duì)小鼠腎臟結(jié)構(gòu)的影響

表2 酪蛋白注射和CD36敲除對(duì)小鼠腎臟功能的影響

*P<0.05vsC57 group;#P<0.05vs C57+casein group.

Figure 6.The change of H2O2levels in the renal tissues of each group. Mean±SEM.n=8.*P<0.05vsC57 group;#P<0.05vsC57+casein group.

圖6酪蛋白注射和CD36敲除對(duì)小鼠腎臟H2O2含量的影響

討 論

CKD是由各種因素引起的慢性腎功能降低，具體表現(xiàn)為3個(gè)月以上的腎小球?yàn)V過率小于 60 mL·(min·1.73 m2)-1和/或具有腎損傷的標(biāo)志物[9]。近年來CKD的全球死亡率大幅增加，2002年CKD位于全球死因的第17位，從1990年到2013年，CKD年死亡率從11.6/10萬人口增加到15.8/10萬人口，據(jù)估計(jì)，到2030年，CKD將成為全球第13大死因[10]。由于腎功能損傷的不可逆性，CKD逐漸進(jìn)展為終末期腎病，并增加不良心血管事件的發(fā)生和總體死亡率[11]。不論何種因素引起的CKD，其主要病理改變都表現(xiàn)為腎小球硬化、腎小管肥大和間質(zhì)纖維化[12]。炎癥在CKD的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用，與CKD患者的預(yù)后密切相關(guān)，但是其具體分子機(jī)制尚不清楚。

在本研究中，我們應(yīng)用酪蛋白注射的方法，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生全身和腎臟局部炎癥反應(yīng)。酪蛋白是牛奶蛋白的主要成分之一，可以激活B淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生非感染性的慢性炎癥反應(yīng)，加重小鼠動(dòng)脈粥樣硬化和非酒精性脂肪性肝病[13]。與傳統(tǒng)注射內(nèi)毒素的急性感染模型相比，酪蛋白注射模型可以誘導(dǎo)體內(nèi)多種炎癥因子的慢性持續(xù)性增加，能更好地模擬患者體內(nèi)的炎癥狀態(tài)。在本實(shí)驗(yàn)中，酪蛋白注射顯著促進(jìn)C57BL/6J小鼠血清和腎臟組織TNF-α含量的增加，并引起C57BL/6J小鼠腎臟損傷，血清肌酐、血清尿素氮及尿蛋白含量顯著增加，腎臟出現(xiàn)腎小球硬化的病理改變。同時(shí)，酪蛋白注射還顯著增加了C57BL/6J小鼠的腎臟組織CD36的蛋白表達(dá)，提示CD36可能參與了炎癥誘導(dǎo)的腎臟損傷。應(yīng)用CD36KO小鼠，我們確認(rèn)了CD36缺失可以保護(hù)酪蛋白所誘導(dǎo)的小鼠腎小球硬化，降低小鼠血清肌酐、血清尿素氮和尿蛋白。腎臟組織的損傷與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，活性氧可以引起DNA或蛋白質(zhì)的氧化損傷，或引起脂質(zhì)過氧化及細(xì)胞凋亡，還可以促進(jìn)血管緊張素II的合成，激活TGF-β1和纖溶酶原激活物抑制物1(plasminogen activator inhibitor 1，PAI-1)信號(hào)通路，促進(jìn)腎小球硬化[14]。在本實(shí)驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn)，CD36KO小鼠可以降低酪蛋白注射小鼠腎臟組織的過氧化氫含量。推測(cè)CD36KO小鼠可能是通過抑制NADPH酶活性或減少脂肪酸氧化，降低組織細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，達(dá)到保護(hù)腎組織的作用。

Figure 7.Observation of Nrf2 expression in the renal tissues by immunohistochemical staining in each group. The scale bar=50 μm. Mean±SEM.n=8.*P<0.05vsC57 group;#P<0.05vsC57+casein group.

圖7酪蛋白注射和CD36敲除對(duì)小鼠腎臟抗氧化能力的影響

Figure 8.Observation of TGF-β1 expression in the renal tissues by immunohistochemical staining in each group. The scale bar=50 μm. Mean±SEM.n=8.*P<0.05vsC57 group;#P<0.05vsC57+casein group.

圖8酪蛋白注射和CD36敲除對(duì)小鼠腎臟纖維化的影響

綜上所述，本研究初步證實(shí)了炎癥應(yīng)激通過上調(diào)腎組織CD36表達(dá)，參與小鼠腎小球硬化的發(fā)生；CD36缺失可能通過降低氧化應(yīng)激保護(hù)炎癥誘導(dǎo)的小鼠腎損傷。因此，CD36可能是預(yù)防和治療CKD的潛在靶點(diǎn)，研發(fā)針對(duì)CD36的抗體和藥物可能存在潛在的臨床重要意義。