除痰解毒方通過(guò)EMT途徑逆轉(zhuǎn)肺癌吉非替尼耐藥*

羅 楊， 童冰杰， 趙 賓， 劉啟歐， 魏玉林， 王淑美

(重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院， 中醫(yī)藥防治代謝性疾病重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 重慶 400016)

肺癌的發(fā)病率和死亡率已經(jīng)成為世界上惡性腫瘤之首，其中又以非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)尤為顯著，約占所有肺癌的85%[1-2]。大多數(shù)患者確診惡性腫瘤時(shí)已經(jīng)發(fā)生了浸潤(rùn)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，放、化療及分子靶向治療為其主要治療手段。以吉非替尼(gefitinib)為代表的肺癌分子靶向藥物屬于表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI),對(duì)EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌具有很好的療效，但幾乎所有患者在1 年內(nèi)都發(fā)生了不同程度的耐藥[1-3]，因此進(jìn)一步探討EGFR-TKI獲得性耐藥的分子機(jī)制和逆轉(zhuǎn)策略刻不容緩。研究表明，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)與EGFR-TKI耐藥密切相關(guān)，逆轉(zhuǎn)EMT可增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI的敏感性[2-6]。除痰解毒方(Chutan-Jiedu decoction,CJD)是李榮亨教授40多年從大量臨床實(shí)踐中總結(jié)出來(lái)的治療肺癌的有效方劑，全方標(biāo)本兼顧，共奏除痰解毒抗腫瘤之功。本文通過(guò)研究除痰解毒方對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株H1975裸鼠移植瘤EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、Snail和波形蛋白(vi-mentin)表達(dá)的影響，探討其逆轉(zhuǎn)肺癌靶向耐藥的作用及機(jī)制，為除痰解毒方的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物與細(xì)胞株

SPF級(jí)4～5周齡BALB/c裸小鼠，均為雄性，體質(zhì)量16～18 g，共66只(6只專用于傳代)，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(京) 2014-0004。人肺腺癌耐藥細(xì)胞株H1975由重慶威斯騰生物醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司惠贈(zèng)。

2 藥物、試劑和主要儀器

除痰解毒方由廣木香7 g、砂仁7 g、黨參15 g、白術(shù)9 g、茯苓15 g、姜半夏5 g、厚樸10 g、陳皮5 g、浙貝母15 g、薏苡仁50 g、紅豆杉3 g、三棱5 g、莪術(shù)5 g、威靈仙7 g、仙鶴草15 g、魚(yú)腥草15 g和金蕎麥15 g組成，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一院中藥房，經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院何先元教授鑒定為正品，將中藥水煎制成終濃度為2.0 kg/L，4 ℃保存；吉非替尼由阿斯利康公司惠贈(zèng)；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone(批號(hào)AAL209012)；胎牛血清購(gòu)自GEMINI(批號(hào)A46F82H)；抗E-cadherin、Snail和vimentin 抗體購(gòu)自Affinity Biosciences(批號(hào)2214t00、9613j14和1886q77)；DAB 顯色試劑盒和兔SP檢測(cè)試劑盒(批號(hào)14188A08)購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

Gel Doc 2000N凝膠成像系統(tǒng)、POWER/PAC 1000電泳儀和熒光定量PCR儀(ABI)；核酸蛋白分析儀(Beckman)；低溫離心機(jī)(Sigma)。

3 主要方法

3.1動(dòng)物造模、分組與給藥 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H1975細(xì)胞懸液(1×1010/L)接種至 6 只裸鼠背部皮下以供傳代(每只0.2 mL)。用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤塊直徑約7 mm時(shí)，麻醉處死裸鼠，剝?nèi)∧[瘤組織，以無(wú)血清培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)濃度為1×1010/L，接種至60 只BALB/c小鼠背側(cè)皮下(每只0.2 mL)。用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤塊直徑約5 mm時(shí)將60 只荷瘤裸小鼠隨機(jī)分為6組：模型(model)組，吉非替尼(0.04 g/kg)組，除痰解毒方低、中、高劑量(13.52 g/kg、27.04 g/kg和54.08 g/kg)組，除痰解毒方中劑量(27.04 g/kg)聯(lián)合吉非替尼(0.04 g/kg)組。每組10只，灌胃，每天1次，連續(xù)14 d。

3.2抑瘤實(shí)驗(yàn) 第15天麻醉后處死裸鼠，稱取瘤質(zhì)量，測(cè)量各組裸鼠移植瘤的最長(zhǎng)徑a(cm)和最短徑b(cm)，計(jì)算腫瘤體積及抑瘤率。腫瘤體積(cm3)=0.52ab2;抑瘤率(%)=(模型組平均瘤質(zhì)量-治療組平均瘤質(zhì)量)/模型組平均瘤質(zhì)量×100%。

3.3免疫組織化學(xué)法檢測(cè)E-cadherin、Snail和vi-mentin的表達(dá) 各組瘤組織切片后，根據(jù)SP試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，加抗E-cadherin、Snail和vimentin抗體及II抗后DAB染色及蘇木精復(fù)染，烘干，封片。應(yīng)用 Image-Pro Plus 6.0軟件分析圖片，選取圖片上具有染料色調(diào)的區(qū)域(area)，測(cè)量該區(qū)域的積分吸光度(IA)值，選擇并測(cè)量有效統(tǒng)計(jì)區(qū)域的面積，計(jì)算選擇區(qū)域內(nèi)的吸光度平均值(IA/area)。

3.4Western blot法檢測(cè)E-cadherin、Snail和vimentin蛋白的表達(dá) 分別采用液氮研磨法和Bradford 法對(duì)組織總蛋白進(jìn)行提取和定量，取60 μg蛋白質(zhì)行SDS-PAGE分離，移至硝酸纖維素膜上。常規(guī)孵育I抗和II抗，顯影，以GAPDH為內(nèi)參照檢測(cè)蛋白表達(dá)。

3.5Real-time PCR法檢測(cè)E-cadherin、Snail和vi-mentin的mRNA表達(dá) 按照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)提取RNA。以紫外分光光度計(jì)A260/A280及瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RNA 濃度測(cè)定。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Thermo Fisher Scientific)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行具體操作。根據(jù)GenBank上所查mRNA序列，采用軟件設(shè)計(jì)引物，以β-actin 作為內(nèi)參照，引物序列見(jiàn)表1。用ABI StepOnePlus PCR System 軟件分析，計(jì)算目的基因的 Ct 值。各目的基因表達(dá)水平的差異比較采用2-ΔΔCt法計(jì)算。ΔΔCt=(處理組目的基因Ct-處理組內(nèi)參照基因Ct)-(對(duì)照組目的基因Ct-對(duì)照組內(nèi)參照基因Ct)。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for real-time PCR

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，Levene檢驗(yàn)判斷方差齊性，方差齊時(shí)組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)采用獨(dú)立樣本Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較

與模型組和吉非替尼組相比，除痰解毒方中、高劑量組及聯(lián)合用藥組的腫瘤體積和質(zhì)量顯著下降(P<0.05)，抑瘤率分別為48.56%、37.73%和61.92%，見(jiàn)表2。

表2 除痰解毒方對(duì)模型小鼠腫瘤生長(zhǎng)的的影響Table 2.The effect of Chutan-Jiedu decoction (CJD) on tumor growth in model mice (Mean±SD. n=10)

*P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsgefitinib group.

2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組移植瘤組織中E-cadherin、Snail和vimentin蛋白的表達(dá)

E-cadherin和vimentin主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，Snail主要表達(dá)于細(xì)胞核，陽(yáng)性表達(dá)呈黃色或棕黃色。除痰解毒方中劑量組和聯(lián)合用藥組E-cadhe-rin蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，Snail和vimentin蛋白表達(dá)水平較模型組與吉非替尼組顯著下調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖1～3及表3。

3 Western blot 檢測(cè)各組移植瘤組織中E-cadhe-rin、Snail和vimentin蛋白的表達(dá)

與模型組比較，吉非替尼組和除痰解毒方低劑量組E-cadherin蛋白的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；除痰解毒方中劑量組、除痰解毒方高劑量組及聯(lián)合用藥組E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，而Snail和vimentin蛋白表達(dá)水平較模型組與吉非替尼組顯著下調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

4 除痰解毒方對(duì)各組移植瘤組織中E-cadherin、Snail和vimentin mRNA表達(dá)的影響

除痰解毒方中劑量組、除痰解毒方高劑量組及聯(lián)合用藥組E-cadherin mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，Snail和vimentinm 的mRNA表達(dá)水平較模型組與吉非替尼組顯著下調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

Figure 1.The result of immunohistochemical staining for observing the expression of E-cadherin (SP, ×400).

圖1免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組腫瘤組織中E-cadherin的表達(dá)

Figure 2.The result of immunohistochemical staining for onserving the expression of Snail (SP, ×400).

圖2免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組腫瘤組織中Snail的表達(dá)

Figure 3.The result of immunohistochemical staining for observing the expression of vimentin (SP, ×400).

圖3免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組腫瘤組織中vimentin的表達(dá)

表3免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組移植瘤瘤組織E-cadherin、Snail和vimentin蛋白的表達(dá)

Table 3.The protein expression of E-cadherin, Snail and vimentin was observed by the method of immunohistochemistry in each nude mouse xenografts (Mean±SD.n=10)

GroupE-cadherinSnailVimentinModel0.143±0.0230.367±0.0410.261±0.029Gefitinib0.155±0.0130.354±0.0280.237±0.036Low-dose CJD0.171±0.016*0.321±0.049*△0.226±0.032*Middle-dose CJD0.195±0.011*△0.238±0.027*△0.177±0.029*△High-dose CJD0.176±0.012*△0.279±0.033*△0.210±0.036*Combined medication0.231±0.025*△0.204±0.028*△0.135±0.031*△

*P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsgefitinib group.

討 論

近年來(lái)，EGFR-TKI藥物的使用給晚期NSCLC患者帶來(lái)了希望，EGFR-TKI藥物已經(jīng)覆蓋了晚期NSCLC的一線、二線和三線治療。但隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，大多數(shù)患者在一年內(nèi)對(duì)EGFR-TKI藥物發(fā)生耐藥，并且病情進(jìn)一步惡化，雖然研制出了二代和三代EGFR-TKI藥物，但其療效不明確、價(jià)格昂貴，難以臨床推廣使用，因此必須研究一種新的治療方案來(lái)克服對(duì)EGFR-TKI的耐藥[2-4]。對(duì)于EGFR-TKI 耐藥機(jī)制的研究很多，主要包括 EGFR-T790M突變、旁路激活、MET基因擴(kuò)增以及EMT等[3-6]。研究證實(shí)腫瘤EMT的發(fā)生與EGFR-TKI耐藥密切相關(guān)，逆轉(zhuǎn)EMT的發(fā)生可延緩對(duì)EGFR-TKI的耐藥[6-8]。

EMT是以E-cadherin等上皮標(biāo)志蛋白表達(dá)的降低以及vimentin等間充質(zhì)蛋白表達(dá)增多為主要特征，與腫瘤的發(fā)生、腫瘤細(xì)胞的原位侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[9-10]。判斷腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的重要檢測(cè)指標(biāo)有E-cadherin、Snail和vimentin。E-cadherin在維持上皮細(xì)胞形態(tài)完整性中發(fā)揮著重要作用，當(dāng)E-cadherin表達(dá)減少或缺失，可使癌細(xì)胞從原發(fā)病灶中脫離，向周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或侵入血管向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，同時(shí)，E-cadherin的表達(dá)還會(huì)影響肺癌患者靶向藥物的治療效果，有研究表明E-cadherin蛋白表達(dá)陽(yáng)性的NSCLC患者預(yù)后較好[4, 9-10]；作為調(diào)控EMT的核心轉(zhuǎn)錄因子Snail，其通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)的E-box序列，抑制上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，并且能導(dǎo)致vimentin和fibronectin等間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子的上調(diào)或重新分配從而促進(jìn)EMT發(fā)生[11-12]；vimentin最初是作為間葉性腫瘤的特異性標(biāo)志物，但逐漸被發(fā)現(xiàn)與患者癌細(xì)胞表達(dá)與預(yù)后相關(guān)，廣泛被認(rèn)為是增強(qiáng)癌侵襲和轉(zhuǎn)移的必備條件[3-5, 12]。

Figure 4.The images of Western blot and quantitative analysis for determining the protein expression of E-cadherin, Snail and vimentin. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsgefitinib group.

圖4Westernblot檢測(cè)E-cadherin、Snail和vimentin的蛋白表達(dá)

Figure 5.The mRNA expression of E-cadherin, Snail and vimentin was detected by real-time PCR in each nude mouse xenografts. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsgefitinib group.

圖5Real-timePCR檢測(cè)各組移植瘤組織中E-cadherin、Snail和vimentin的mRNA表達(dá)

中醫(yī)藥可廣泛應(yīng)用于肺癌治療的各個(gè)階段，有研究表明中藥可協(xié)同提高肺癌對(duì)分子靶向藥物療效，對(duì)晚期肺癌治療具有重要的臨床意義[13-17]。除痰解毒方中廣木香、砂仁、黨參、白術(shù)、茯苓、姜半夏、厚樸、陳皮和甘草健脾理氣化痰；三棱、莪術(shù)和浙貝母活血散結(jié)化痰；紅豆杉、薏苡仁、魚(yú)腥草和金蕎麥清熱解毒散結(jié)；威靈仙祛風(fēng)防轉(zhuǎn)移；仙鶴草益氣補(bǔ)虛固脫。全方標(biāo)本兼顧，共奏益氣補(bǔ)虛、健脾化痰、解毒散結(jié)、理氣消積、通絡(luò)祛風(fēng)之功。

本研究結(jié)果顯示除痰解毒方中、高劑量組能顯著抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，表明除痰解毒方有一定的抗腫瘤作用；單用吉非替尼抑瘤作用不明顯，但聯(lián)合除痰解毒方后其抑瘤作用更加明顯，表明除痰解毒方具有增強(qiáng)靶向藥吉非替尼療效的作用，從而延緩靶向耐藥的發(fā)生；同時(shí)，除痰解毒方可不同程度地上調(diào)E-cadherin蛋白及mRNA的表達(dá)，下調(diào)Snail和vimentin蛋白及mRNA的表達(dá)，且除痰解毒方聯(lián)合吉非替尼比單獨(dú)用藥組效果更佳，說(shuō)明除痰解毒方聯(lián)合吉非替尼具有協(xié)同增效的作用，除痰解毒方逆轉(zhuǎn)肺癌吉非替尼耐藥的機(jī)制可能與升高E-cadherin蛋白的表達(dá)，降低Snail和vimentin的表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果表明聯(lián)合用藥組比單獨(dú)用藥組效果更佳，但其具體機(jī)制還不明確，下一步我們將重點(diǎn)研究其是通過(guò)何種信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)協(xié)同增效的作用。