MicroRNA-98通過下調(diào)EZH2表達抑制結直腸癌細胞的活力與侵襲能力*

張 娟， 馮 燕， 和水祥△

(1西安交通大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科， 陜西 西安 710061； 2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科， 新疆 烏魯木齊 830001)

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是最常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，其發(fā)病率居惡性腫瘤第3位，死亡率居惡性腫瘤的第4位[1]。在我國，結直腸癌的死亡率和發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[2]。盡管結直腸癌的治療方法已經(jīng)有了很大的進步，但因影響其發(fā)生和侵襲的原因尚未研究清楚，其復發(fā)和轉(zhuǎn)移仍十分常見。因此，探索結直腸癌的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點，在CRC的治療中具有重要意義。Zeste基因增強子同源物2(enhancer ofZestehomolog 2，EZH2)基因是胚胎生長發(fā)育以及X染色體失活調(diào)節(jié)的重要基因之一[3]。研究表明，EZH2基因在包括結直腸癌的多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4]。微小RNA(microRNA，miRNA, miR)是一類由18～25個核苷酸組成的非編碼RNA，能夠通過與目的基因mRNA的3’端非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，3’-UTR)堿基序列靶向互補結合，抑制或沉默靶基因的表達，從而參與到細胞的生長、分化、代謝和凋亡等生物學過程中[5]。關于miRNA的異常表達與結直腸癌的診斷、治療及預后之間的關系已多有報道[6]。通過生物信息學軟件預測出miR-98與EZH2之間可能存在靶向調(diào)節(jié)關系，并且已有研究表明miR-98在肺癌、食管癌和鼻咽癌等多種癌癥中異常表達，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7-8]。最新的研究表明，miR-98在結腸癌組織中表達偏低，其表達與腫瘤惡性程度呈負相關[9]。本研究旨在探討miR-98在結直腸癌中的作用，并通過上調(diào)和下調(diào)miR-98，了解其對人結直腸癌細胞系SW480和SW620活力和侵襲的影響，并探討其可能的分子機制。

材 料 和 方 法

1 材料和試劑

胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自杭州四季青公司；Leibovitz’s L-15培養(yǎng)液購自HyClone；擴增引物購自上海吉瑪公司；點突變試劑盒購自TaKaRa； LipofectamineTM3000購自Invitrogen； miR-98 mimic/inhibitor購自上海吉凱基因化學技術有限公司；I抗和 II 抗購自BD。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng) 人結直腸癌細胞系SW480和SW620購于美國模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC),細胞培養(yǎng)于混合10% FBS、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的Leibovitz’s L-15培養(yǎng)液中，置于37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞生長至90%融合狀態(tài)后傳代，取對數(shù)期生長狀況良好的細胞進行后續(xù)實驗。

2.2雙螢光素酶報告基因?qū)嶒?采用TargetScan軟件(http://www.targetscan.org/vert_72/)預測出miR-98的靶向基因EZH2，雙螢光素酶報告實驗驗證靶向關系。首先構建EZH2的野生型(wild type, WT)和突變型(mutant, Mut)表達質(zhì)粒。實驗所用引物由上海生工生物工程有限公司合成，野生型質(zhì)粒的上游引物序列為5’-AAGTGAAGTGTGGTCCCTGG-3’，下游引物序列為5’-ATCATCTGGCTGGTTCTCCC-3’；突變型質(zhì)粒的上游引物序列為5’-CATCTGCTACTTCCTAGAAA-3’，下游引物序列為5’-ATTATATAAAGGCGTGTTTGCTC-3’；擴增出與miR-98相結合的EZH2的3’-UTR片段。擴增產(chǎn)物經(jīng)過純化、酶切與連接過程導入雙螢光素酶真核表達載體pmirGLO中，構建出野生型表達質(zhì)粒。用點突變試劑盒擴增突變片段，隨后構建EZH2突變型表達質(zhì)粒。取生長良好的SW480細胞按每孔5×104的密度接種至24孔細胞培養(yǎng)板，孵育24 h后，用LipofectamineTM3000將EZH2 WT或EZH2 Mut表達質(zhì)粒與miR-98 mimic或mimic control一起共轉(zhuǎn)染SW480細胞。轉(zhuǎn)染24 h后加入螢光素酶檢測試劑，測定螢火蟲螢光素酶的活性，隨后加入Stop&Glo試劑測定海腎螢光素酶的活性，相對螢光素酶活性以螢火蟲螢光素酶與海腎螢光素酶活性之比表示。

2.3實驗分組 實驗分為正常對照(control)組(正常培養(yǎng)的結直腸癌SW480細胞和SW620細胞)、miR-98 mimic組(結直腸癌細胞轉(zhuǎn)染miR-98過表達試劑miR-98 mimic)、mimic control組(結直腸癌細胞轉(zhuǎn)染mimic control)、miR-98 inhibitor組(結直腸癌細胞轉(zhuǎn)染miR-98抑制試劑miR-98 inhibitor)和inhibitor control組(結直腸癌細胞轉(zhuǎn)染inhibitor control)。細胞經(jīng)處理后培養(yǎng)48 h進行后續(xù)檢測。

2.4RT-qPCR法檢測miR-98表達的變化 采用常規(guī)的TRIzol法提取結腸癌細胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后用SYBR Green進行RT-qPCR。反應體系為SYBR Green Mix 9 μL、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL、forward primer 2 μL和reverse primier 2 μL,加水至總體積20 μL。反應參數(shù)為:95 ℃ 20 s; 95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 10 s， 35個循環(huán)；72 ℃延伸1 min。以U6 snRNA為內(nèi)參照。miR-98的上游引物序列為5’-GGGGTGAGGTAGTAAGTTGT-3’，下游引物序列為5’ -TGCGTGTCGTGGAGTC-3’；U6上游引物序列為5’- GCGCGTCGTGAA GCGTTC-3’，下游引物序列為5’- GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。實驗結果miR-98和U6產(chǎn)物倍數(shù)按2-ΔΔCt計算。

2.5MTT法檢測細胞活力 細胞分組處理后用MTT法檢測其細胞活力。各組細胞以每孔6×104個接種于96孔板，并且每組細胞設置3個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄去原培養(yǎng)液后每孔加入MTT(5 g/L)20 μL，置于37 ℃培養(yǎng)4 h。棄去上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min使結晶充分溶解，使用酶標儀上檢測各組細胞490 nm波長的吸光度(A490值)，并計算細胞活力，細胞活力(%)=處理組A490值/對照組A490值×100%。

2.6Transwell法檢測細胞的侵襲能力 在膜孔徑為8 μm的24孔Transwell上室聚碳酸酯膜上涂抹Matrigel(70 μL，1 g/L)，靜置于37 ℃下60 min致使膠體在微孔濾膜上重組成為基底膜。用胰酶消化待測細胞，將收集到的細胞懸液用1 000 r/min離心8 min。棄去上清后，用不含F(xiàn)BS的M199培養(yǎng)液將細胞重懸, 取1×108/L的細胞懸液200 μL接種于Transwell上室內(nèi)，并在下室中加入含有20%胎牛血清的M199培養(yǎng)液500 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。隨后將濾膜上層的細胞用棉簽抹去，用甲醇固定濾膜，Giemsa染色15 min。于200倍光鏡下選擇膜左、右、上、中、下5個視野用細胞計數(shù)板計算侵襲到下層的細胞數(shù)量。

2.7Western blot檢測EZH2的蛋白表達 收集各組細胞，加入0.25%胰蛋白酶消化后，用PBS緩沖液清洗細胞3次；加入65 μL RIPA細胞蛋白裂解液，SDS-PAGE分離蛋白；電泳結束后轉(zhuǎn)膜，再用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入稀釋1 000倍的鼠抗人EZH2和GAPDH的I 抗，4 ℃輕搖過夜，加入稀釋5 000倍的HRP標記的羊抗鼠 II 抗，室溫孵育1 h。X線片曝光分析，結果用Image-Pro Plus處理，以目的蛋白與內(nèi)參照β-actin的灰度值比值表示蛋白的相對表達量。

2.8EZH2表達載體的構建 提取SW480細胞總RNA進行反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，PCR擴增。PCR條件為:95 ℃ 5 min; 95℃ 30 s、59℃ 30 s、72℃ 30 s，30個循環(huán)；最后在72 ℃下延伸5 min。擴增EZH2的引物由上海生工生物工程有限公司合成，上游引物序列為5’-AGAGGTACCGGACGAAGAATAATCATGG-3’，下游引物序列為5’-TAGCTCGAGGGTAGCAGATGTAAGG-3’。在上、下游分別引入EcoR I與KpnI的酶切位點及保護性堿基。用EcoR I和KpnI雙酶切PCR擴增得到的目的基因以及質(zhì)粒載體pcDNA3.1，分別收集目的片段后使用T4連接酶進行連接，構建重組pcDNA3.1- EZH2質(zhì)粒，并進行酶切鑒定和送至上海生工生物工程有限公司進行測序鑒定。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。實驗數(shù)據(jù)用單因素方差分析進行統(tǒng)計學分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 miR-98在SW480細胞中靶向調(diào)節(jié)EZH2

TargetScan軟件預測出miR-98的靶向基因EZH2。在SW480細胞中進行雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-98和EZH2之間的靶向關系，結果顯示，螢光素酶活性在miR-98 mimic和野生型EZH2表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組中顯著降低(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.miR-98 targeted EZH2 in SW480 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsother groups.

圖1miR-98在SW480細胞中靶向調(diào)節(jié)EZH2

2 miR-98影響SW480和SW620細胞中EZH2的表達

為了證明在結直腸癌細胞中miR-98和EZH2之間的靶向關系，我們檢測了過表達和抑制miR-98對SW480細胞和SW620細胞中EZH2表達的影響。與control組相比，miR-98的表達在miR-98 mimic組中顯著升高，在miR-98 inhibitor組中明顯降低(P<0.05)，說明miR-98 mimic和miR-98 inhibitor成功轉(zhuǎn)染到腫瘤細胞中。Western blot結果表明，與control組相比，EZH2蛋白的表達在miR-98 mimic組顯著降低，在miR-98 inhibitor組中升高(P<0.05),見圖2。

Figure 2.The effect of miR-98 on EZH2 expression in the SW480 cells (A) and SW620 cells (B). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2miR-98對SW480細胞和SW620細胞中EZH2表達的影響

3 miR-98影響SW480和SW620細胞的活力

MTT法實驗結果顯示，在2種結直腸癌細胞系中，與control組相比，miR-98 mimic顯著抑制細胞的活力，miR-98 inhibitor明顯促進細胞的活力(P<0.05)，見圖3。

4 miR-98影響SW480細胞和SW620細胞的侵襲能力

Transwell實驗檢測SW480細胞和SW620細胞的侵襲能力，結果顯示，與control組相比，過表達miR-98使細胞的侵襲能力明顯降低，而抑制miR-98使細胞的侵襲能力顯著增高(P<0.05)，見圖4。

5 EZH2過表達可上調(diào)SW480細胞和SW620細胞的活力和侵襲能力

為了進一步證明miR-98和EZH2之間的調(diào)控關系，我們構建了EZH2過表達質(zhì)粒，與miR-98 mimic共轉(zhuǎn)染SW480細胞和SW620細胞，結果顯示，與miR-98 mimic組相比，EZH2的蛋白表達在miR-98 mimic+pcDNA3.1-EZH2組中顯著升高(P<0.05)，表明EZH2過表達質(zhì)粒的構建和轉(zhuǎn)染成功,見圖5A。MTT實驗和Transwell實驗分別檢測細胞活力和侵襲能力，結果表明，與miR-98單獨轉(zhuǎn)染組相比，EZH2的過表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染顯著增強SW480細胞和SW620細胞的活力和侵襲能力(P<0.05),見圖5B、C。

Figure 3.The effect of miR-98 on the viability of SW480 cells and SW620 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3miR-98對SW480細胞和SW620細胞活力的影響

Figure 4.The effect of miR-98 on the invasion ability of SW480 cells and SW620 cells (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4miR-98影響SW480和SW620細胞的侵襲

討 論

EZH2基因位于人染色體的7q35區(qū)，是PcG(Polycomb Group)家族中的PRC2復合物的核心組成部分[10]。EZH2可以通過調(diào)節(jié)染色體組蛋白的甲基化水平抑制下游基因的表達，調(diào)節(jié)細胞生理機能[11]。研究發(fā)現(xiàn)，EZH2高表達的細胞侵襲和增殖能力較強，此現(xiàn)象在多種人類腫瘤細胞中得到證實[12]。已有研究表明，EZH2在結直腸癌細胞中高表達，并且其表達與癌癥的組織學分化程度、淋巴結轉(zhuǎn)移以及TNM分期相關[13]。另有報導指出EZH2不僅影響結腸癌細胞的生長、侵襲、代謝等，而且對細胞的耐藥性生成也有影響，可見EZH2作為促癌基因在結直腸癌中發(fā)揮重要作用[14]。

EZH2在腫瘤細胞中異常高表達的原因尚未清楚，但前期在多種疾病中的研究已表明miRNA是一個重要的調(diào)控因素。miRNA是機體內(nèi)一種位于基因組非編碼區(qū)的內(nèi)源性小分子RNA，廣泛存在于各類真核細胞中，其本身并不具有開放閱讀框無法進行蛋白翻譯，但可以通過和靶基因進行特異的堿基配對引起靶基因mRNA的翻譯抑制或者降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達，進而影響蛋白的合成，參與到機體代謝、個體發(fā)育以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等生物進程中[15]。本研究通過TargetScan軟件預測得出miR-98可能與EZH2之間存在靶向調(diào)節(jié)關系。研究表明miR-98能夠參與多種疾病的調(diào)節(jié)。Bi等[16]報道m(xù)iR-98通過調(diào)節(jié)Col1A1基因表達抑制增生性瘢痕細胞的生長;Cheng等[17]闡明miR-98通過抑制TGFBR1的表達減弱心肌成纖維細胞的分化，另外miR-98在心肌炎的調(diào)控中也起著重要作用[18]?？梢妋iR-98可以通過調(diào)控不同的靶基因影響各類疾病的進程。本研究結果表明螢光素酶活性在miR-98和EZH2野生型雙螢光素酶表達質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染組中顯著降低，證實了miR-98和EZH2之間的靶向調(diào)節(jié)關系。并且miR-98的過表達顯著降低，同時miR-98的抑制顯著提升EZH2蛋白在結直腸癌細胞SW480和SW620中的表達，說明miR-98有可能通過靶向EZH2參與結直腸癌疾病的調(diào)節(jié)。

Figure 5.EZH2 over-expression increased the viability and invasion ability of SW480 cells and SW620 cells. A: the protein level of EZH2 was detected by Western blot; B: the cell viability was detected by MTT assay; C: the invasion ability of SW480 and SW620 cells was detected by Transwell assay (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmiR-98 mimic group.

圖5EZH2過表達上調(diào)SW480和SW620細胞活力和侵襲能力

miR-98在多種腫瘤中均表現(xiàn)為低表達，參與腫瘤調(diào)節(jié)。Tan等[19]發(fā)現(xiàn)，miR-98通過調(diào)節(jié)MTDH基因抑制頭頸部鱗狀細胞癌細胞的生長、侵襲和遷移。Huang等[20]報道m(xù)iR-98通過調(diào)節(jié)E2F1降低白血病細胞的化療藥物耐藥性。另有研究者闡明miR-98通過調(diào)節(jié)IKBKE/NF-κB通路增加神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞凋亡，抑制腫瘤發(fā)展。最新研究表明miR-98在結腸癌患者的癌組織中低表達，并且在結直腸癌細胞系SW480和HCT116中的研究表明，miR-98可以通過調(diào)節(jié)HK2基因抑制癌細胞的Warburg效應[9]。因為EZH2與細胞生長和侵襲之間具有緊密的聯(lián)系，本文檢測了miR-98對結直腸癌細胞SW480和SW620生長和侵襲的影響。研究結果表明過表達miR-98降低結直腸癌細胞的生長和侵襲，而抑制miR-98表達提升癌細胞的生長和侵襲能力，說明miR-98在結直腸癌中發(fā)揮了抑癌作用，與前人的結果一致。最后通過EZH2過表達實驗，我們驗證了miR-98對結直腸癌細胞生長和侵襲的調(diào)節(jié)作用是通過靶向抑制EZH2表達產(chǎn)生的。

綜上所述，本研究表明miR-98對結直腸癌細胞SW480和SW620的生長和侵襲有抑制作用，且其作用是通過靶向調(diào)節(jié)EZH2產(chǎn)生的。這為理解結直腸癌的分子機制提供了新的理論基礎，并對疾病的治療提供了新的靶點。