全反式維甲酸通過作用于JNK/P38 MAPK信號通路減輕大鼠腦缺血再灌注引起的血腦屏障損傷*

李明航， 田曉翠， 安瑞娣， 張 倩， 楊 梅， 向 菲， 王鈺淳， 徐 露， 董 志

(重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 重慶市生物化學(xué)與分子藥理重點實驗室， 重慶 400016)

腦血管疾病是目前嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，其中缺血性腦血管疾病所占比重更大[1]，該類疾病的發(fā)病原因主要是腦組織供血中斷，短時間內(nèi)不能恢復(fù)血供，其治療的基本策略是及時恢復(fù)缺血區(qū)的血液供應(yīng)。但是若超過治療時間窗，重新恢復(fù)腦組織的血液供應(yīng)會進一步加重大腦功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷，即腦缺血再灌注(cerebral ischemia-reperfusion，CIR)損傷[2]。在缺血再灌注早期，血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)的不可逆破壞會導(dǎo)致血管源性腦水腫，從而引發(fā)繼發(fā)性腦損傷。血腦屏障是存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和血液之間的一道物理屏障，其主要功能是監(jiān)管出入物質(zhì)的轉(zhuǎn)運，保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)免受各種內(nèi)外因素的傷害；因此，BBB在維持大腦內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)中起著重要的作用[3]?；|(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein-9，MMP-9)是與血腦屏障密切相關(guān)的一種基質(zhì)金屬蛋白酶，它通過降解血腦屏障基底膜以及內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接，參與組織重塑以及血腦屏障的破壞，當(dāng)血腦屏障損傷時可以觀察到大量的MMP-9 表達[4-6]，已有研究發(fā)現(xiàn)絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路是參與血腦屏障保護作用的一條關(guān)鍵通路[7]。全反式維甲酸(all-transretinoic acid，ATRA)是動物體內(nèi)維生素A的代謝中間產(chǎn)物，有著廣泛的生理學(xué)和藥理學(xué)活性，有研究發(fā)現(xiàn)其有強大的抗氧化和抗炎作用[8]。本實驗擬建立SD大鼠CIR損傷模型并給予ATRA干預(yù)，觀察ATRA對CIR損傷后大鼠的神經(jīng)功能、血腦屏障通透性及JNK/P38 MAPK信號通路的影響，探討其可能的保護作用機制。

材 料 和 方 法

1 動物

清潔級雄性SD大鼠65只，體重250～280 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(渝)2012-0001。

2 主要試劑

ATRA、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC)和伊文思藍(lán)染液(Sigma)；明膠酶譜檢測試劑盒(上海信帆生物科技有限公司)；抗claudin-5抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；抗occludin、ZO-1和MMP-9抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；抗JNK、p-JNK、P38和p-P38抗體(CST)；Western blot相關(guān)試劑(上海碧云天生物有限公司)。

3 主要方法

3.1實驗動物分組和處理 將SD雄性大鼠隨機分成假手術(shù)(sham)組、模型(CIR)組及ATRA(10、30和90 mg/kg)組。參照參考文獻[9]用線栓法建立大鼠中動脈栓塞模型，缺血1.5 h后,緩慢拔出線栓，消毒，縫合傷口。Sham組除不插入線栓外與模型組行相同操作，ATRA組大鼠術(shù)后立即腹腔注射ATRA(10、30和90 mg/kg)，sham組和模型組注射等體積的溶劑。

3.2神經(jīng)行為學(xué)評分 再灌注24 h后，采用Longa等[10]的評分標(biāo)準(zhǔn)對不同處理組的大鼠進行神經(jīng)行為學(xué)評分。Longa評分標(biāo)準(zhǔn)分5個等級：0分：正常，無神經(jīng)功能缺損；1分：左側(cè)前爪不能完全伸展，輕度神經(jīng)功能缺損；2分：行走時，大鼠向左側(cè)(癱瘓側(cè))轉(zhuǎn)圈，中度神經(jīng)功能缺損；3分：行走時，大鼠身體向左側(cè)(癱瘓側(cè))傾倒，重度神經(jīng)功能缺損；4分：不能自發(fā)行走，有意識喪失。

3.3腦梗死體積測定 各組大鼠于再灌注24 h后深度麻醉并斷頭取腦，置-20 ℃冰箱15 min，以視交叉為起點冠狀切為連續(xù)5片(1 mm)，然后置于2% TTC 染色液中37 ℃避光孵育30 min。染色后正常腦組織呈紅色，而梗死區(qū)域呈白色。將腦切片放入4%多聚甲醛中固定24 h，用濾紙去除腦片多余的多聚甲醛試液，置于藍(lán)色背景下，數(shù)碼相機拍照，采用Image-Pro Plus 5.0軟件測定腦梗死體積。

3.4腦組織含水量測定 各組大鼠分別于再灌注24 h后深度麻醉處死，并快速斷頭取腦，分離大腦半球，立即測其濕重，測完濕重后置于100 ℃ 的電烤箱約 24 h，然后迅速測其干重，記錄所測數(shù)據(jù)，按照以下公式計算了大鼠的腦水含量：腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

3.5血腦屏障通透性的評估 再灌注24 h后，從大鼠尾靜脈注射2%伊文思藍(lán)溶液2 mL/kg，其黏膜和四肢等表淺部瞬間變藍(lán)。待伊文思藍(lán)在大鼠體內(nèi)循環(huán) 60 min后，用生理鹽水500 mL+4%多聚甲醛 500 mL 灌注并固定(甲酰胺提取法檢測的大鼠則不用固定)，固定完成后迅速斷頭取腦，置于冰上，進行以下的實驗步驟：(1) 腦表面攝影：將固定后的大鼠全腦沿冠狀面視交叉前的區(qū)域連續(xù)切片，每片厚度2 mm，總共5片，將腦片在白色背景上擺放整齊后照相; (2) 甲酰胺提取法：大鼠深度麻醉后用生理鹽水滴注，不固定。之后斷頭取出大鼠腦組織用生理鹽水沖洗，濾紙吸去殘余水分，待稱量完大鼠缺血側(cè)大腦半球濕重后，將其放入3 mL 二甲基甲酰胺溶液中，水浴箱60 ℃恒溫孵育24 h，10 000 r/min離心 30 min，取 200 μL上清液加入96孔酶標(biāo)板中，于630 nm 處測定吸光度(A)值。對倍稀釋法制作伊文思藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出伊文思藍(lán)的含量，結(jié)果以μg/g 腦組織來表示。

3.6明膠酶譜法檢測MMP-9的活性 再灌注24 h后，提取待測腦組織的總蛋白，提取的總蛋白不煮沸，不變性，按照MMP-9明膠酶譜法檢測試劑盒說明書檢測MMP-9的活性。凝膠中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮區(qū)域，從而能同時指示MMP-9的大小位置(酶譜)及活性。

3.7Western blot 檢測組織中MMP-9、JNK/P38通路蛋白和緊密連接蛋白的水平 大鼠再灌注24 h 后，深度麻醉后迅速斷頭取腦，用液氮速凍，按照說明書提取大鼠缺血側(cè)半腦的總蛋白并測定其含量，各組蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE 進行分離，切膠，濕法轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂牛奶封閉2 h 后加入I抗[MMP-9(1∶1 000)、JNK(1∶1 000)、p-JNK(1∶500)、P38(1∶1 000)、p-P38(1∶500)、claudin-5(1∶200)、occludin(1∶1 000)和ZO-1(1∶1 000)]于4 ℃孵育過夜。用TBST洗膜3次，每次5 min,采用3步法，生物素標(biāo)記 II 抗(1∶2 000)結(jié)合，再結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)記的streptavidin(1∶3 000)。洗膜后，采用增強化學(xué)發(fā)光液進行曝光顯影。應(yīng)用Image Lab 圖像分析軟件分析條帶A值，計算蛋白的相對表達量，以目的條帶與內(nèi)參照β-actin吸光度的比值作為蛋白相對表達量。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用統(tǒng)計分析軟件SPSS 13.0對數(shù)據(jù)進行處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，各組間差異的兩兩比較采用Tukey’st檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ATRA對CIR誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)功能缺損的影響

再灌注24 h后，與sham組相比，CIR組的神經(jīng)行為學(xué)評分升高，出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的神經(jīng)行為功能缺失;與CIR組相比，ATRA(10和30 mg/kg)可以降低大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分,表明ATRA能減輕CIR誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)功能缺損，其中30 mg/kg 的ATRA效果最佳，見圖1。

Figure 1.The effect of ATRA on CIR-induced neurological function defect in the rats. Mean±SD.n=11.**P<0.01vssham group;#P<0.05vsCIR group.

圖1ATRA對CIR誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)功能缺損的影響

2 ATRA對CIR損傷后大鼠腦梗死體積的影響

與sham組相比，再灌注24 h后，CIR組缺血側(cè)腦半球出現(xiàn)了大面積白色梗死區(qū)域,腦梗死體積顯著升高；與CIR組相比，ATRA(10和30 mg/kg)干預(yù)可以縮小梗死范圍(P<0.01)，見圖2。

Figure 2.The effect of ATRA on the volume of cerebral infarction in CIR rats. Mean±SD.n=11.##P<0.01vssham group;**P<0.01vsCIR group.

圖2ATRA對CIR損傷后大鼠腦梗死體積的影響

3 ATRA對CIR后大鼠腦含水量和血腦屏障通透性的影響

CIR組大鼠腦含水量和伊文思藍(lán)含量明顯高于sham組;與CIR組相比，ATRA(10和30 mg/kg)干預(yù)可以降低腦含水量和伊文思藍(lán)含量(P<0.01)，見圖3。

Figure 3.The effect of ATRA on brain water content (A) and blood-brain barrier permeability (B) after CIR in the rats. Mean±SD.n=11.##P<0.01vssham group;**P<0.01vsCIR group.

圖3ATRA對CIR后大鼠腦含水量和血腦屏障通透性的影響

4 ATRA對CIR后大鼠腦組織MMP-9活性和蛋白表達的影響

與sham組相比，CIR組缺血側(cè)腦組織MMP-9的蛋白表達量及活性均增加;與CIR組相比，ATRA(10、30和90 mg/kg)能降低MMP-9蛋白的表達量及活性(P<0.01)，見圖4。

5 ATRA對CIR損傷后大鼠腦組織緊密連接蛋白表達的影響

再灌注24 h后，CIR組大鼠大腦組織緊密連接蛋白claudin-5、occludin和ZO-1的表達水平明顯低于sham組;與CIR組相比，ATRA組(30 mg/kg)干預(yù)能減少緊密連接蛋白的降解(P<0.01)，見圖5。

6 ATRA對大鼠CIR后JNK、P38及其p-JNK、p-P38蛋白水平的影響

CIR組的JNK/p38 MAPK通路明顯激活，JNK和P38磷酸化水平明顯升高;與CIR組相比，ATRA(10和30 mg/kg)明顯減少p-JNK和p-P38的含量，抑制JNK和P38的激活(P<0.01)，見圖6。

討 論

缺血性腦血管疾病是嚴(yán)重威脅人類生命健康的常見疾病之一，致殘率及死亡率極高，腦缺血再灌注損傷是一個復(fù)雜的病理過程，有研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦損傷時，血腦屏障遭受了嚴(yán)重的破壞，血管的通透性增加，血液中多種成分外滲，從而加重了腦組織損傷[11]。血腦屏障的功能障礙在缺血性腦血管疾病中起著關(guān)鍵的作用[12-13]。保護血腦屏障的完整性被認(rèn)為是一種治療缺血性腦卒中的新療法[14]。

Figure 4.The effect of ATRA on the protein expression (A) and activity (B) of MMP-9 in rat brain tissues after CIR. Mean±SD.n=11.##P<0.01vssham group;*P<0.05,**P<0.01vsCIR group.

圖4ATRA對CIR后大鼠腦組織MMP-9活性和蛋白表達的影響

Figure 5.The effect of ATRA on the protein expression of tight junction proteins in rat brain tissues after CIR injury. Mean±SD.n=11.##P<0.01vssham group;*P<0.05,**P<0.01vsCIR group.

圖5ATRA對CIR損傷后大鼠腦組織緊密連接蛋白表達的影響

Figure 6.The effect of ATRA on the protein levels of JNK, P38, p-JNK and p-P38 after CIR in rats. Mean±SD.n=10.##P<0.01vssham group;**P<0.01vsCIR group.

圖6ATRA對大鼠CIR后JNK、P38、p-JNK和p-P38蛋白水平的影響

基質(zhì)金屬蛋白酶是一類主要參與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)降解的蛋白酶超家族，其中MMP-9與腦缺血再灌注后血腦屏障的破壞關(guān)系最為密切[7]。正常的腦組織中，MMP-9的含量僅有低水平的表達，在急性腦缺血發(fā)生時, MMP-9 在腦組織中表達明顯增高，降解內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接蛋白、IV 型膠原、V 型膠原等血管基底膜成分，導(dǎo)致血管通透性增加，破壞血腦屏障, 參與腦缺血病理過程[5]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn), 腦缺血再灌注24 h后，MMP-9的蛋白表達及活性均增加，緊密連接蛋白表達量降低，伊文思藍(lán)和腦含水量均增加; ATRA干預(yù)組的腦組織MMP-9 表達明顯減少,緊密連接蛋白降解程度減小，伊文思藍(lán)和腦含水量均降低,其中30 mg/kg ATRA的效果最佳，提示ATRA血腦屏障保護作用可能與降低MMP-9 活性有關(guān)。

有研究表明,MAPK級聯(lián)途徑是參與血腦屏障損傷作用的一條關(guān)鍵通路[15-16]。JNK和P38是MAPK通路的關(guān)鍵蛋白，近年來國外的研究也證實JNK/P38 MAPK 通路幾乎全都涉及了缺血性腦損傷所有的生理病理過程，是參與血腦屏障損傷的一條最為關(guān)鍵的通路[15]。研究發(fā)現(xiàn)，在多種刺激條件下，p38 MAPK 通路參與介導(dǎo)了誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的生成[17]。腦缺血再灌注后產(chǎn)生大量的一氧化氮(nitric oxide，NO)，其中 NO通過鳥苷酸環(huán)化酶對MMP-9進行調(diào)節(jié)[18]，進而促進了缺血性腦損害的發(fā)展。全反式維甲酸是維生素A的一種活性代謝產(chǎn)物，介導(dǎo)維生素A的絕大部分生物學(xué)功能。以前的研究發(fā)現(xiàn)，維甲酸在血腦屏障的形成中起重要作用[19]。而我們的研究結(jié)果提供了一些有關(guān)全反式維甲酸對缺血再灌注破壞的血腦屏障的保護作用的新見解。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，再灌注24 h后，模型組大鼠腦組織中的p-JNK和p-P38蛋白表達增加，ATRA干預(yù)可以明顯抑制p-JNK和p-P38蛋白表達，30 mg/kg的效果最佳，并且實驗發(fā)現(xiàn)腦缺血后JNK和P38的總蛋白表達總量基本沒有變化。以上結(jié)果提示，全反式維甲酸可能通過抑制JNK和P38的活化來減輕大鼠腦缺血再灌注引起的血腦屏障損傷。

但是，關(guān)于全反式維甲酸對血腦屏障的保護作用機制依然有很多問題需要進一步探討。例如，本實驗主要研究全反式維甲酸在腦缺血再灌注損傷的預(yù)后作用，全反式維甲酸的預(yù)防作用還需進一步研究明確。更重要是，全反式維甲酸高劑量(90 mg/kg)沒有達到預(yù)期的保護作用，因此需要進一步論證全反式維甲酸的給藥時間和給藥劑量。