， ，，

手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)是一種兒童常見的自限性傳染病，多發(fā)于1～5歲的兒童，其臨床癥狀為嬰幼兒發(fā)熱和手、足、口腔和臀等處的皮疹或皰疹[1-2]。引起HFMD的病原體有多種，其中以腸道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)和柯薩奇病毒A16型(Coxsackievirus A16,CA16)最為常見[3]。EV71屬于小RNA病毒科、腸道病毒屬A組的成員，為單股正鏈RNA病毒。基因組全長約7 400 bp，位于基因組兩端的5′和3′非編碼區(qū)(untranslated regions,UTRs)在病毒的復(fù)制和蛋白的翻譯中發(fā)揮著重要作用[4]。病毒基因組僅含有一個開放閱讀框(open reading frame,ORF)，編碼一個由2 193個氨基酸組成的多聚蛋白，分為結(jié)構(gòu)前體蛋白P1和非結(jié)構(gòu)前體蛋白P2、P3。P1蛋白可進(jìn)一步加工為結(jié)構(gòu)蛋白VP1～VP4，其中VP1區(qū)是病毒基因分型的主要依據(jù)。一般情況下，兒童感染EV71與感染CA16病毒后的臨床癥狀不易區(qū)分[5]，但相對而言，EV71感染所引起的HFMD可能伴有神經(jīng)性肺水腫和急性弛緩性麻痹、無菌性腦膜炎等神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，嚴(yán)重地危害了嬰幼兒的健康[1, 6]。

近年來EV71在國內(nèi)的流行呈顯著上升趨勢，其中以C4基因型為主[7]。在江蘇省境內(nèi)每年都能檢測出EV71病毒的疫情，比對這些毒株的序列后發(fā)現(xiàn)，流行的毒株主要屬于C4a亞型[8]。因此加強(qiáng)對中國大陸各地區(qū)EV71流行毒株的基因特征分析，對于有效地預(yù)防和控制手足口病的流行具有重要的意義。本文通過從患者糞便樣品中分離出的2株EV71病毒，對其進(jìn)行全基因組序列比對、基因分型和種系進(jìn)化關(guān)系分析等研究，以期為EV71的變異研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標(biāo)本來源 EV71感染糞便標(biāo)本收集自南京市兒童醫(yī)院2017年5-7月經(jīng)臨床診斷為EV71感染手足口病的入院治療患兒。糞便采集后立即分裝至2 mL凍存管，于-80 ℃低溫冷凍保存。

1.2 方法

1.2.1糞便中EV71的分離、復(fù)制 取糞便標(biāo)本0.3 g，加入1.5 mL PBS制成20%糞便懸液，充分混勻，12 000 r/min離心20 min。取上清液1 mL至新的離心管，加入100 μL氯仿，充分混勻，12 000 r/min離心15 min，離心后取200 μL上清加入2.8 mL含有2%FBS DMEM中，接種于致密單層的Vero細(xì)胞上。細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，接種后每天觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，若出現(xiàn)CPE，則取100 μL陽性上清液傳至新的Vero細(xì)胞中，2 h后吸棄上清液，換成含有2%FBS DMEM，繼續(xù)觀察細(xì)胞CPE變化。CPE達(dá)到75%以上時(shí)，收集病變細(xì)胞液，-80 ℃保存。如7 d后沒有出現(xiàn)CPE，盲傳3代，仍未見CPE出現(xiàn)，則判為陰性。

1.2.2引物設(shè)計(jì)與合成 引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[9]。選取GenBank中EV71各地區(qū)代表株的全基因組序列，經(jīng)序列比對后找出病毒基因序列的保守區(qū)域，采取分段擴(kuò)增方式依序設(shè)計(jì)8對首尾相互重疊、覆蓋基因組全長的引物(見表1)。引物序列由通用生物系統(tǒng)有限公司合成。

表1 EV71全基因組分段擴(kuò)增和測序的引物Tab.1 Primers used for fractional amplification and sequencing of whole genome of EV71

1.2.4序列測定與數(shù)據(jù)分析 8段特異性擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物送至通用生物系統(tǒng)有限公司進(jìn)行序列測定。通過Chromas軟件顯示各段產(chǎn)物依序位置的堿基峰圖對測序所得的序列進(jìn)行可靠性分析，通過SeqMan軟件將比對的序列依序組裝成一條完整的全基因序列。同時(shí)從NCBI基因數(shù)據(jù)庫(GenBank)中下載EV71各基因型代表毒株序列共24條，見表2。應(yīng)用Megalign軟件對EV71分離毒株的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行同源性比對分析，應(yīng)用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(Bootstrap值為1 000)。

表2 序列分析中所用EV71毒株信息Tab.2 Background of EV71 strains in sequence analysis

2 結(jié) 果

2.1病毒分離 將臨床檢測為EV71-RNA陽性的36份手足口病患者的糞便標(biāo)本，處理后分別接種至致密生長的Vero細(xì)胞，培養(yǎng)分離出2個陽性分離物。陽性分離物再次接種Vero細(xì)胞，培養(yǎng)2 d后，鏡下觀察可見細(xì)胞圓縮、透亮、聚堆的病變現(xiàn)象，見圖1。

A: Control Vero cells；B: CPE on Vero cells infected with NJ2017iso1 after 48 h；C: CPE on Vero cells infected with NJ2017iso2 after 48 h圖1 Vero細(xì)胞感染NJ2017分離株后的細(xì)胞病變(×200)Fig.1 CPE on Vero cells infected with EV71 isolates

2.2PCR產(chǎn)物鑒定 EV71陽性糞便分離物感染Vero細(xì)胞后提取RNA，采用8對特異性設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%濃度瓊脂糖凝膠電泳，顯示各條擴(kuò)增片段均與引物設(shè)計(jì)的理論擴(kuò)增長度相符，見圖2。

M: DNA Marker DL2000; A: EV71-NJ2017iso1 infected-products were amplified fractionally by PCR with 8 pairs of specific primer; B: EV71-NJ2017iso2 infected-products were amplified fractionally by PCR with 8 pairs of specific primer圖2 NJ2017分離株8對引物PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electropherogram of PCR products of EV71 isolates

2.3基因組序列的測定及分析 經(jīng)分段擴(kuò)增，序列測定和比對拼接后，獲得NJ2017 iso1和NJ2017 iso2的全基因組序列，并將序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，基因序列號分別為MG581490和MG520666。EV71-NJ2017 iso1基因組全長為7 365 bp，其中5’UTR區(qū)長為692 bp，3′UTR區(qū)為89 bp；NJ2017 iso2基因組全長為7 358 bp，其中5′UTR長為705 bp，3′UTR區(qū)長81 bp。兩株EV71基因組編碼區(qū)均為6 582個核苷酸，僅含有一個開放閱讀框，編碼一含2 193個氨基酸殘基的多聚蛋白(polyprotein)，經(jīng)基因組序列比對，兩分離株核苷酸同源性達(dá)到94.0%。從表3可看出，NJ2017 iso2與EV71 BrCr原型株基因組的核苷酸和氨基酸同源性分別為79.8%和95.0%。

2.4基因組核苷酸序列同源性比對 將NJ2017 iso1,2株與來自GenBank中不同EV71代表株的核苷酸序列進(jìn)行同源性分析，選擇NJ2017 iso2作為參照。從表3中可以看出，無論是全基因組，或是在5′UTR，衣殼蛋白(VP1，VP4)，非衣殼蛋白(2A，3C，3D)的各個分區(qū)中，NJ2017 iso2與Fuyang 17.08-02的核苷酸同源性最高，為96.9%，與EV71 BrCr的同源性最低，為79.8%。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，南京市分離株之間的5′UTR和3D區(qū)存在顯著的差異性，分別為74.4%和37.6%。

2.5編碼蛋白氨基酸序列同源性比較 NJ2017 iso1,2株病毒基因組編碼區(qū)全長6 582個核苷酸，共編碼2 193個氨基酸。將NJ2017 iso2株與其他EV71型毒株氨基酸序列進(jìn)行同源性比對，見表3。從編碼的氨基酸組成成分分析，NJ2017 iso2株與Fuyang 17.08-02的氨基酸同源性最高，與NJ2017 iso1株同源性最低。雖然在核苷酸序列上，NJ2017分離株與這24株病毒株序列之間的差異變化顯著，但氨基酸序列的同源性均高達(dá)95%以上，說明EV71病毒基因組中大多數(shù)核苷酸序列變異屬無義突變，相應(yīng)氨基酸序列的遺傳變化相對穩(wěn)定。

表3 南京市分離株NJ2017 iso2與其它分離株的核苷酸(nt)及氨基酸(aa)的同源性比較(%)Tab.3 Homology comparison of the nucleotide and amino acid sequence between NJ2017 iso2 and other EV71 isolates(%)

2.6病毒基因的種系進(jìn)化分析 從GenBank上下載24株中國大陸各省市和亞太國家及地區(qū)的EV71代表株的全基因組序列，使用MEGA 7.0軟件通過鄰位歸并法(Neighbor-joining)，基于病毒外殼蛋白VP1基因和全基因組核苷酸序列，對NJ2017 iso1,2株與25株代表株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。無論在VP1基因(圖3)還是在全基因組序列(圖4)水平上構(gòu)建的進(jìn)化樹中均可以看出，NJ2017 iso1,2株與C4亞型Fuyang 17.08-2、BJ08-Z020-1、Lanzhou01等株進(jìn)化關(guān)系密切，同屬于C4a進(jìn)化分支，而與A型BrCr國際標(biāo)準(zhǔn)株、B亞型Xiamen/2009、26M/AUS/4/99、3799-SIN-98等株在進(jìn)化上較遠(yuǎn)，這與核昔酸序列同源性比對的結(jié)果相符。NJ2017 iso1,2株與中國大陸各省市分離的10株代表株之間進(jìn)化關(guān)系較近，分析結(jié)果與有關(guān)國內(nèi)EV71主要代表毒株的基因型是C4亞型相符[10]。

圖3 NJ2017 iso1,2株VP1序列遺傳進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the VP1 gene between NJ2017 iso1,2 and the representatives of each subgenotype

The representative strains and its Genbank accession numbers are listed in Phylogenetic tree，which are shown on the branches as Bootstrap values圖4 NJ2017iso 1,2株全基因組序列遺傳進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on the full-length genome between NJ2017iso 1,2 and the representatives of each subgenotype

3 討 論

近年來，EV71已逐漸成為繼脊髓灰質(zhì)炎病毒后又一重要的嗜神經(jīng)腸道病毒。自1969年首次在美國加州被報(bào)道以來，EV71病毒已經(jīng)在世界范圍內(nèi)引起多次大規(guī)模的暴發(fā)，但不同國家和地區(qū)的流行毒株的基因型存在顯著差異。如1997-1999年新加坡、澳大利亞等亞太國家是以B3亞型感染為主；臺灣省在1998年以C2亞型感染為主，而2000年之后逐漸被B4亞型取代。2008年以來在中國大陸的EV71感染引發(fā)的HFMD流行中，神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的發(fā)病率逐年上升，因而加強(qiáng)對EV71毒株基因型的特征分析和流行病學(xué)的監(jiān)控，在HFMD的預(yù)防及控制中有著重要的臨床價(jià)值。本文通過對南京市2017年分離的2株EV71型病毒株的全基因組進(jìn)行了序列測定、同源性分析及親緣進(jìn)化關(guān)系等方面的研究，為了解目前南京地區(qū)流行的EV71毒株的病原特征及遺傳變異情況提供了重要的信息。

EV71病毒基因組僅含有1個開放閱讀框，編碼的一個多聚蛋白在自身蛋白酶的酶解作用下形成P1、P2、P3區(qū)前體蛋白，P1區(qū)可進(jìn)一步加工形成病毒衣殼蛋白VP1、VP2、VP3和VP4。P2和P3區(qū)主要編碼非結(jié)構(gòu)蛋白如2A、3C蛋白酶及3D RNA聚合酶，進(jìn)化上具有高度保守性[11]。EV71的4種結(jié)構(gòu)蛋白中，被廣泛用于EV71基因分型的是VP1和VP4。VP4區(qū)核苷酸序列僅為207 bp，易擴(kuò)增，但其高度保守，和VP1區(qū)相比核苷酸變異較少。而VP1位于病毒衣殼外側(cè)，是目前EV71分型最常應(yīng)用的區(qū)域?；赩P1序列的同源性差異，目前將EV71分為A、B、C基因型。其中，A基因型為EV71的原型株[12]；B基因型可進(jìn)一步分為B1～B5亞型，主要包括澳大利亞、新加坡部分地區(qū)、臺灣省和馬來西亞的病毒株；C基因型可劃分為C1～C5亞型，主要是在亞太地區(qū)，包括中國大陸及臺灣省、新加坡和馬來西亞等地。

本研究采用RT-PCR方法分段擴(kuò)增EV71南京市分離株NJ2017 iso1,2的基因組序列，并對其核苷酸序列進(jìn)行了測定及分析，經(jīng)序列拼接后得到病毒全基因組序列。本文主要對EV71的5′UTR區(qū)的核苷酸序列，結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP4以及非結(jié)構(gòu)蛋白2A、3C、3D的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行同源性分析。經(jīng)同源性比對發(fā)現(xiàn)，NJ2017 iso1,2之間全基因核苷酸序列和氨基酸序列同源性分別為94.0%和90.1%，VP1、VP4、2A、3C蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列也具有高度同源性，但5′UTR區(qū)(25.6%)和3D蛋白(62.4%)的核苷酸序列差異較明顯。本研究將NJ2017 iso1,2株與下載自GenBank中EV71流行株的核苷酸和氨基酸序列分別進(jìn)行同源性分析，選擇NJ2017 iso2作為參照。分析顯示，NJ2017 iso2與A基因型和B基因型病毒株在VP1區(qū)的核苷酸序列差異均在15%以上，而與C基因型毒株在VP1區(qū)核苷酸序列差異均低于12%，其中與C4亞型各毒株的同源性較高，表明南京分離株均屬于C4亞型毒株。經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)，NJ2017 iso2與2008年安徽阜陽分離株Fuyang 17.08-02(96.9%)以及2008年北京分離株BJ08-Z020-1(96.7%)的核苷酸同源性最高，與EV71原型株BrCr(79.8%)的同源性最低。從同源性分析表中可以直觀地發(fā)現(xiàn)，雖然南京市分離株與其他地區(qū)EV71分離株之間核苷酸序列差異顯著，但其氨基酸序列變化相對穩(wěn)定。

2A、3C蛋白不僅作為病毒自身合成的蛋白裂解酶，在EV71的固有免疫逃避中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用[13]。2A，3C 蛋白的核苷酸和氨基酸同源性分析可以看出，南京市 2 株 EV71 分離株之間同源性很高，這為病毒的體外感染和逃避宿主免疫起到了重要的作用。本實(shí)驗(yàn)中 2 株分離株的 3D 區(qū)核苷酸序列比對在所有區(qū)域中差異最大，這與Jiang等[14]和 Li 等[15]的研究結(jié)果相一致。3D蛋白可啟動正鏈RNA的復(fù)制和VPg尿苷酸化的起始及終止[16]，3D區(qū)核苷酸序列部分堿基的突變?yōu)椴《镜倪M(jìn)化提供了條件，同時(shí)自然選擇壓力又使病毒蛋白保持著較高的穩(wěn)定性。同源性分析表中還可以發(fā)現(xiàn)，EV71南京市分離株之間的5′UTR區(qū)核苷酸序列差異性顯著。5′UTR通過自身折疊形成的多個特異性結(jié)構(gòu)與宿主的相關(guān)細(xì)胞蛋白結(jié)合，在起始病毒基因組RNA的合成以及病毒蛋白翻譯的過程中發(fā)揮重要作用[17]。此外，5′UTR區(qū)還涉及病毒的毒力等方面的功能。南京市分離株之間5′UTR區(qū)核苷酸的顯著性差異可能對其致病性產(chǎn)生的影響還需要進(jìn)一步的研究。

基于VP1區(qū)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，南京市分離株NJ2017與C4a基因亞型毒株聚成一簇，因此我們判斷其為C4a亞型，這符合中國大陸地區(qū)近年來EV71病毒暴發(fā)的流行趨勢[18]，也說明南京市2017年EV71分離株沒有出現(xiàn)明顯的亞型變異。從進(jìn)化樹上可知，南京市分離株與上海、浙江等地的病毒分離株有較高的親緣關(guān)系，同屬于C4a基因亞型，可能是由于南京往返于上海、浙江等地的人員較為頻繁，為病毒的快速傳播提供了條件。然而EV71全基因組中結(jié)構(gòu)蛋白基因僅占35%，而非結(jié)構(gòu)蛋白則超過55%，腸道病毒之間的同源重組位點(diǎn)多位于非結(jié)構(gòu)編碼區(qū)[19]，因此有研究認(rèn)為僅以VP1區(qū)進(jìn)行基因分型及進(jìn)化分析會忽略 EV71 其他基因突變的信息，不能提供完整的種系發(fā)生關(guān)系[20]，因此應(yīng)參考 EV71 的全基因組序列對毒株完成基因分型及進(jìn)化分析[21]。通過對全基因組的進(jìn)化分析顯示，A、B、C型分別位于3個大的分支中，與VP1區(qū)構(gòu)建的進(jìn)化樹結(jié)構(gòu)大體相似，但各基因亞型所在的分支并不完全相同，可能是不同的亞型之間存在著其他的變異信息。從兩株進(jìn)化樹中可以看出，基于VP1基因序列分型的C4a亞型Guangdong 2009株在全基因組水平構(gòu)建的進(jìn)化樹中被C4b亞型毒株分隔開以及B4亞型SB2864-SAR-00株單獨(dú)成枝，說明僅依據(jù)VP1基因序列對EV71毒株進(jìn)行基因分型是不能提供完整的種系進(jìn)化信息。

近年來中國內(nèi)地各地區(qū)EV71的暴發(fā)常以C4基因型為主，在病毒感染的早期階段多為隱性感染，這為HFMD疫情的防控增加了難度。本研究通過對南京市EV71感染引發(fā)的HFMD患者的糞便樣品進(jìn)行了EV71病毒的分離并完成了病毒全基因組序列的測定及基因同源性和遺傳進(jìn)化分析，結(jié)果顯示本研究中2017年南京市分離株均為C4a基因型，研究結(jié)果為南京市EV71的流行趨勢研究和防控工作提供了參考依據(jù)。目前EV71的發(fā)病率仍呈上升趨勢，但相應(yīng)疫苗的研發(fā)已進(jìn)入了臨床階段[22-23]，相信不久的將來腸道病毒71型也會同脊髓灰質(zhì)炎病毒一樣被完全治愈。