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彎曲菌(Campylobacter)是一種重要的人獸共患病原菌，能夠引起人細(xì)菌性腹瀉、急性腸炎以及吉蘭巴雷綜合征，同時也能引起牛和綿羊流產(chǎn)。導(dǎo)致人致病的彎曲菌主要有空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni，C.jejuni)和結(jié)腸彎曲菌(Campylobactercoli，C.coli)[1-2]。彎曲菌可通過食物鏈傳播給人，禽肉是感染人的主要來源。

彎曲菌是畜禽動物腸道的常在菌。近年來，在畜禽養(yǎng)殖過程中，抗生素的廣泛應(yīng)用使彎曲菌產(chǎn)生了耐藥性，隨著時間的推移，耐藥性不斷增強，并且耐藥譜不斷擴增。耐藥彎曲菌的出現(xiàn)有可能通過食物鏈轉(zhuǎn)移到人體，從而對人類的健康和公共衛(wèi)生造成威脅。為了控制細(xì)菌耐藥性，我國農(nóng)業(yè)部制定了《全國遏制動物源性細(xì)菌耐藥行動計劃(2017-2020)》，彎曲菌耐藥監(jiān)測也納入行動計劃，在全國范圍內(nèi)進一步加強動物源彎曲菌耐藥性監(jiān)測。鑒于此，本研究對江蘇某大型肉雞屠宰加工廠不同環(huán)節(jié)彎曲菌的分離、鑒定及其耐藥性進行分析，為我國動物源性彎曲菌耐藥性現(xiàn)狀的了解和評估提供可靠的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1標(biāo)準(zhǔn)菌株 空腸彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(NCTC-11168)、結(jié)腸彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC33559)和大腸埃希氏菌(ATCC25922)由本實驗室保存。

1.1.2培養(yǎng)基 Cary-Blair運送培養(yǎng)基、CCDA培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基、BHI培養(yǎng)基均購自于英國OXOID公司；彎曲菌分離用抗生素三甲氧芐氨嘧啶、頭孢哌酮、多粘菌素B、兩性霉素B、利福平和放線菌酮等購自日本W(wǎng)AKO公司；脫纖維綿羊血購買于青島海博生物技術(shù)有限公司；厭氧罐購自日本MGC公司；混合氣(5% O2、10% CO2和85% N2)購于南京特種氣體廠有限公司。

1.1.4藥敏紙片 共選擇6大類抗生素中的14種常規(guī)藥敏紙片，包括青霉素類的氨芐西林(Ampicillin，AMP，10 μg)、阿莫西林(Amoxicillin，AML，10 μg)；第三代頭孢中的頭孢噻肟(Cefotaxime，CTX，30 μg)和頭孢曲松(Ceftriaxone，CRO，30 μg)；氨基糖苷類的鏈霉素(Streptomycin, S，10 μg)、慶大霉素(Gentamicin，CN，10 μg)、阿米卡星(Amikacin，AK，30 μg)、妥布霉素(Tobramycin，TOB，10 μg)和卡那霉素(Kanamycin，K，30 μg)；喹諾酮類的萘啶酸(Nalidixic acid，N，30 μg)、環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，CIP，5 μg)和氧氟沙星(Ofloxacin，LEV，5 μg)；大環(huán)內(nèi)酯類的紅霉素(Erythromycin，E，15 μg)以及四環(huán)素類的四環(huán)素(Tetracycline，TE，30 μg)；以上藥敏紙片均購買于英國OXOID公司。

1.2 方 法

1.2.1樣品采集 根據(jù)肉雞屠宰流程隨機進行采樣，主要包括：屠宰前泄殖腔棉拭子、脫毛后的胴體、開膛后的胴體、消毒預(yù)冷后胴體、成品雞、工作臺面及工人手拭子樣品。泄殖腔棉拭子采用無菌棉簽擦拭法，棉拭子采集后存放于Cary-Blair運送培養(yǎng)基中；(胴)體、工作臺面及工人的手使用含PBS的滅菌棉球均勻擦拭，將擦拭好的棉球置于采樣袋內(nèi)。所有樣品均低溫保存運回實驗室進行檢測。

1.2.2樣品處理 樣品處理方法參照文獻[3]。其具體的步驟為：泄殖腔樣品的處理，從運送培養(yǎng)基中取出棉拭，置于含1 mL滅菌 PBS的指形管中，充分浸透，胴體擦拭樣品擠出PBS溶液；分別將浸液和擠出的PBS溶液經(jīng)適當(dāng)倍比稀釋后取100 μL涂布CCDA平板；微需氧條件42 ℃培養(yǎng)36 h，同時設(shè)陰性和陽性對照。

1.2.3菌株分離純化 細(xì)菌的分離鑒定參照文獻[3]并略作修改。其步驟為：挑取CCDA平板上的可疑菌落接種于MH血平板42 ℃微需氧培養(yǎng)36 h，重復(fù)2～3次，直至得到單一純培養(yǎng)菌落。挑取單菌落加入20 μL超純水中混勻，煮沸15 min，取出立即置于冰上，8 000 r/min離心5 min，取1 μL上清進行PCR檢測，引物序列見表1。鑒定陽性的菌落以密集劃線的方式接種于MH血平板上培養(yǎng)36 h后，用適量的含有20%甘油的BHI培養(yǎng)基洗脫菌苔，置于-80 ℃冷凍保存。

1.2.4藥敏試驗 采用CLSI推薦的紙片擴散法(Kirby-Bauer，K-B)進行抗生素藥物敏感性試驗[4]，選擇6大類14種抗生素，14種藥敏紙片名稱及判斷標(biāo)準(zhǔn)見表2。結(jié)果按照CLSI(2015)標(biāo)準(zhǔn)進行結(jié)果判斷。

1.2.5耐藥基因檢測 對分離得到的菌株分別擴增I型整合子攜帶情況；檢測分離得到的彎曲菌tet(O)基因攜帶情況以及氨基糖苷類耐藥基因簇aadE-sat4-aphA-3的分布，所用引物序列如表1。PCR反應(yīng)體系：ExTaqpremix 12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 1 μL，無菌去離子水9.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性30 s，根據(jù)不同引物選擇相應(yīng)的退火溫度，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。對耐氟喹諾酮類藥物的彎曲菌進行g(shù)yrA相關(guān)區(qū)域擴增測序，PCR反應(yīng)體系為：PrimeSTAR HS(Premix) 12.5 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 1 μL，無菌去離子水9.5 μL； PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳成像。選取PCR陽性樣品送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行序列測定，測序結(jié)果在NCBI上進行BLAST分析。

表1 目的基因引物序列及片段長度Tab.1 Primer sequences of target gene and gene length

2 結(jié) 果

2.1肉雞屠宰加工各環(huán)節(jié)中彎曲菌檢出情況 共檢測樣品170份，檢出彎曲菌124株，空腸彎曲菌16株，結(jié)腸彎曲菌108株，分離率為72.95%。肉雞屠宰前其彎曲菌分離率為23.3%，雞只經(jīng)過電暈、放血、褪毛、掏出內(nèi)臟等過程其污染率迅速上升，經(jīng)過預(yù)冷消毒后，雞胴體污染率有所下降，但到成品雞其污染率又升高達到90%，具體結(jié)果見表2。

2.2彎曲菌分離株藥敏試驗結(jié)果 由表3藥敏實驗結(jié)果表明，彎曲菌分離株對鏈霉素、妥布霉素、卡那霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、萘啶酸、紅霉素和四環(huán)素產(chǎn)生了很強的耐藥性，耐藥率100%；對氨基糖苷類的慶大霉素和阿米卡星較敏感；對青霉素的氨芐西林和阿莫西林也較敏感，其耐藥率分別為11.36%和13.64%。彎曲菌耐藥情況嚴(yán)重，多重耐藥(耐3類及以上抗生素)率達100%，其優(yōu)勢耐藥譜主要為CTX-CRO-cDA-K-NOR-S-AZM-CIP-TE-NA-E-LEV-ENR-TOB，占79.5%?；铍u泄殖腔、脫毛后胴體、開膛后胴體以及成品雞各階段的耐藥譜型都比較單一，工人手和工作臺面的耐藥譜型相對比較復(fù)雜。從活雞到成品雞是同一批次同一來源，所以耐藥譜型相對比較單一，而工人手和工作臺面接觸了不同批次的雞，消毒不徹底就會相互污染，其耐藥譜型相對比較多樣。

表2 肉雞屠宰加工環(huán)節(jié)彎曲菌檢出情況Tab.2 Isolation of Campylobacter strains from different section in slaughter and processing chain

表3 彎曲菌分離株對抗生素的耐藥性Tab.3 Results of antimicrobial resistance testing of Campylobacter isolates

2.3I類整合子的攜帶情況 對分離得到的124株彎曲菌進行I型整合子擴增，未擴增到目的條帶，說明在分離得到的耐藥菌中整合子介導(dǎo)耐藥機制沒有起主導(dǎo)作用。

2.4PCR檢測彎曲菌分離株gyrA基因點突變結(jié)果 對124株彎曲菌gyrA基因耐藥決定區(qū)進行序列分析發(fā)現(xiàn)，耐氟喹諾酮藥物的菌株在第257位堿基均發(fā)生了C-T的突變，導(dǎo)致蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼帷?/p>

2.5四環(huán)素類耐藥基因tet(O)基因檢測結(jié)果 124株四環(huán)素表型耐藥的彎曲菌分離株中，均檢測出tet(O)基因，檢出率為100%，PCR擴增結(jié)果見圖1。對部分菌株P(guān)CR產(chǎn)物進行了測序確定為目的片段。

2.6aadE-sat4-aphA-3耐藥基因簇檢測結(jié)果 圖2為彎曲菌的檢測結(jié)果，aadE-sat4-aphA-3耐藥基因簇PCR擴增片段為1 538 bp，對部分菌株P(guān)CR產(chǎn)物進行了測序，確定為目的片段。124株彎曲菌中aadE-sat4-aphA-3陽性菌株有112株，檢出率為90.32%。

M：核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000；泳道1-22：為彎曲桿菌分離株aadE-sat4-aphA-3耐藥基因簇的PCR擴增結(jié)果圖2 彎曲菌分離株aadE-sat4-aphA-3耐藥基因簇PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplification of aadE-sat4-aphA-3 gene cluster in Campylobacter isolates

3 討 論

由于彎曲菌能夠在家禽腸道內(nèi)大量定植，在屠宰的過程中如果腸道破裂很容易污染屠宰場地、設(shè)施和水從而污染禽肉產(chǎn)品[9-10]。對30多個國家調(diào)查表明，市場上出售的75%的活禽和80%的禽肉中含有彎曲菌，彎曲菌在雞中已經(jīng)廣泛分布[11]。本研究從170份樣品中共分離出124株彎曲菌，總分離率為72.95%。在屠宰前，肉雞泄殖腔棉拭子分離率為23.3%，與張秀麗[12]報道活雞泄殖腔的分離率相似，在屠宰過程中雞胴體的平均檢出率為83.33%，與焦揚等[13]報道的雞胴體分離率88.97%接近。本試驗結(jié)果表明肉雞經(jīng)過屠宰加工環(huán)節(jié)后，其胴體彎曲菌污染率高于屠宰前活雞的檢出率，表明肉雞加工環(huán)節(jié)是彎曲菌發(fā)生交叉污染的主要原因，應(yīng)加強家禽屠宰環(huán)節(jié)彎曲菌的監(jiān)測與控制。

由于疾病治療及抗生素類飼料添加劑的大量使用，使彎曲菌耐藥性迅速傳播，且其耐藥性逐漸增強。食源性動物中彎曲菌的耐藥性已經(jīng)成為發(fā)達國家和發(fā)展中國家共有的主要公共衛(wèi)生問題。國內(nèi)外已有大量的研究論文報道彎曲菌的多重耐藥現(xiàn)象[14-16]。Lim SK等[14]對從雞的泄殖腔和胴體分離到的彎曲菌進行耐藥性檢測，結(jié)果表明：空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌對環(huán)丙沙星、萘啶酸都具有較高的耐藥率。張艾煜等[17]對我國不同來源的彎曲菌進行了抗生素敏感性分析，結(jié)果顯示我國菌株對喹諾酮類為接近95%的高耐藥率。本研究分離的124株彎曲菌藥敏試驗結(jié)果顯示：彎曲菌對鏈霉素、妥布霉素、卡那霉素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、萘啶酸、紅霉素和四環(huán)素產(chǎn)生了很強的耐藥性，耐藥率100%；對慶大霉素、阿米卡星、氨芐西林和阿莫西林較敏感，結(jié)果顯示本試驗所分離彎曲菌的多重耐藥情況相當(dāng)普遍和嚴(yán)重。

整合子-基因盒(Integron gene cassette)系統(tǒng)可將耐藥基因在同種甚至不同種菌株間水平轉(zhuǎn)移，加速多重耐藥菌株的產(chǎn)生，危害嚴(yán)重。本試驗的124株多重耐藥細(xì)菌中，未檢出I型整合子，與Alessandra Piccirillo[18]的結(jié)果一致，遠低于國內(nèi)胡欣潔[19]報道的98.6%。喹諾酮類耐藥決定區(qū)gyrA基因核苷酸C-257-T的點突變是導(dǎo)致彎曲菌對氟喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥的主要原因之一[20]，本研究對124株彎曲菌gyrA基因耐藥決定區(qū)測序發(fā)現(xiàn)在257位堿基發(fā)生了C-T的突變，推測這是導(dǎo)致彎曲菌分離株對喹諾酮類耐藥的主要原因。tet(O)基因編碼的核糖體保護蛋白是彎曲菌對四環(huán)素耐藥的主要機制之一[21]。124株彎曲菌tet(O)檢出率為100%，與Qin(100%)等的結(jié)果相似[22]。氨基糖苷類耐藥的基因簇—aadE-sat4-aphA-3能介導(dǎo)鏈霉素、卡那霉素和新霉素等耐藥，但不能介導(dǎo)慶大霉素耐藥，該基因簇的存在是耐藥菌株在多重氨基糖苷類抗生素壓力下的選擇結(jié)果，因此，選擇該基因監(jiān)測對于耐藥彎曲菌的監(jiān)測具有重要意義。本研究對124株彎曲菌進行了aadE-sat4-aphA-3耐藥基因簇的檢測，其陽性率為90.32%，高于張艾煜的10.86%檢出率[8]，其原因可能是本研究雞源分離株來源比較單一導(dǎo)致了比較高的檢出率。

本研究分析了江蘇省某肉雞屠宰加工過程中不同環(huán)節(jié)彎曲菌的污染和耐藥表型及耐藥基因攜帶情況，結(jié)果顯示，肉雞屠宰加工過程中彎曲菌的污染較為嚴(yán)重，分離株耐藥率較高且多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重。