吳 洋，閆 戈，張慶新，馬曉昱，劉云云，遲 強，陳 瑤

心腦血管病是致殘率和病死率都極高的疾病，抗凝血藥物是抗血栓藥物研制的熱點?？寡ㄖ谐伤幰蜃饔萌鏈睾?，不良反應低受到人們的關注［1］。中成藥質量標準多以藥品中某個或某些成分的含量測定作為主要檢測指標，但該方法在化學成分與藥理作用評價相關性方面還存在一定的差距［2］，特別是復方或含有動物藥成分的藥品，很難以某一成分的含量作為評價藥品質量和藥理作用的標準。復方蝮蛇膠囊是解放軍第406醫(yī)院研制的純中藥制劑，由地龍、蝮蛇毒、丹參、川芎和當歸等多種藥材組成，具有益氣行氣、活血逐瘀的作用，臨床用于治療各種腦血栓中風后遺癥之半身不遂、口眼歪斜、手足發(fā)麻、發(fā)涼等癥，取得了良好的治療效果。該制劑建立了薄層色譜鑒別和HPLC法定量測定阿魏酸含量的質量標準，然而阿魏酸含量的高低卻很難反映與制劑活血化瘀療效的關系。研究表明抗凝血酶活性與活血化瘀作用具有一定的相關性［3-5］，如何通過抗凝作用的定量評價提供藥品抗血栓作用的強弱？該研究在前人研究的基礎上，采用抗凝血酶活性為指標，對復方蝮蛇毒膠囊抗凝血作用的強度進行測定，為復方中成藥質量標準和藥理作用相關性提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

METTLER AE240電子天平；AS-B超聲波清洗儀；潔凈工作臺；Thermo移液器；電熱恒溫水浴鍋。凝血酶（批號223D063，1000U/支，索來寶生物科技有限公司）；牛纖維蛋白原（批號601B0210，索來寶生物科技有限公司）；復方蝮蛇毒膠囊樣品（解放軍第 406 醫(yī)院，批號 141018、141019、141020）；氯化鈉注射液（批號1701110722，辰欣藥業(yè)股份有限公司），三羥甲基氨基甲烷（批號20180117，國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 抗凝血酶的含量測定［2，6，7］

2.1.1 供試品溶液的制備 取地龍粉末1.08 g，精密稱定，精密加入0.9%氯化鈉溶液5 ml，充分攪拌，浸提30 min，時時振搖，離心，4000 rpm/min離心15 min，上清液作為供試品溶液A；取蝮蛇毒末0.0144 g，同法配制供試品溶液B；取地龍粉末1.08 g和蝮蛇毒粉末0.0144 g，同法配制供試液C；取3個批號制劑樣品，每個批號分別取18粒膠囊內容物約 7.2 g（含約地龍 1.08 g，蝮蛇毒 0.0144 g），精密稱定，精密加入0.9%氯化鈉溶液30 ml，同法配制供試品溶液 D1 （批號 141018），D2 （批號 141019）和D3（批號141020）；按照同等比例取無地龍和蝮蛇毒的中藥材混合物6.1 g，精密稱定，精密加入0.9%氯化鈉溶液30 ml，同法配制供試品溶液E。上述供試液A，D和E分別稀釋20倍，供試液B和C分別稀釋120倍，作為最終相應供試品溶液。

2.1.2 陽性對照溶液的制備 取水蛭粉末1 g，精密稱定，同法配制，作為水蛭陽性對照溶液。

2.1.3 陰性對照溶液的制備 以0.9%氯化鈉溶液作為陰性對照溶液。

2.1.4 牛纖維蛋白原溶液的制備 精密取牛纖維蛋白原的凝固物適量，加三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液，制成含量為0.5%的溶液（臨用前配制）。

2.1.5 凝血酶溶液的制備 取凝血酶1000 U，加0.9%氯化鈉溶液，制備成1000 U/ml的貯備液，再取適量加0.9%氯化鈉溶液制備成40 U/ml的凝血酶溶液。

2.1.6 測定方法 精密量取供試品溶液100 μl，置試管（8 mm×38 mm）中，加入含 0.5%（牛）纖維蛋白原溶液 200 μl，搖勻，置水浴中（37±0.5） ℃溫浸5 min，滴加每1 ml中含40單位的凝血酶溶液（每1 min滴加1次，每次1 μl，邊滴加邊輕輕搖勻）至凝固，記錄消耗凝血酶溶液的體積，按下式計算，結果見表1。

表1 復方蝮蛇毒膠囊抗凝血酶活性比較

C1V1式中U——每1 g含凝血酶活性單位，U/g；C1——凝血酶溶液的濃度，μ/ml；C2——供試品溶液的濃度，g/ml；C2V2V1——消耗凝血酶溶液的體積，μl；V2——供試品溶液的加入量，μl；

該結果顯示，蝮蛇毒為本制劑中抗凝血效果最強的藥物，抗凝血作用>160000 U/g，其次為地龍抗凝血作用>300 U/g，植物藥材混合物也具有一定的抗凝血活性，抗凝血活性接近200 U/g。制劑抗凝血酶活性平均值為333 U/g。

2.2 不同影響因素對抗凝血酶活性測定的影響

2.2.1 供試品濃度對抗凝血酶活性測定的影響分別取2.1項下未稀釋的供試品溶液，稀釋20倍的供試品溶液和稀釋120倍的供試品溶液進行抗凝血酶活性測定。結果見表2。

實驗先參照水蛭的抗凝血酶活性實驗進行，水蛭可以形成穩(wěn)定的凝固狀態(tài)，而蝮蛇毒原液和蝮蛇毒+地龍樣品無論怎樣增加凝血酶的體積都無法形成穩(wěn)定的凝固狀態(tài)，相比較提取體積大的制劑則可以形成半凝固狀態(tài)，進一步稀釋后，中藥材、制劑和地龍樣品在稀釋20倍后出現(xiàn)穩(wěn)定的凝固狀態(tài)，而蝮蛇毒單品和蝮蛇毒+地龍樣品只能呈現(xiàn)半凝固狀態(tài)，因此繼續(xù)增加了稀釋倍數(shù)，稀釋至120倍后，呈現(xiàn)穩(wěn)定的凝固狀態(tài)。因此，該實驗不同的樣品最終采用了不同的稀釋倍數(shù)。水蛭為原液，地龍、中藥材和制劑樣品選擇稀釋20倍，蝮蛇毒單品和蝮蛇毒+地龍樣品采用稀釋120倍。

表2 不同稀釋倍數(shù)對供試品溶液抗凝血酶活性的影響

2.2.2 凝血酶濃度對抗凝血酶活性測定的影響凝血酶為逐次滴加，不同濃度凝血酶在滴加后形成的凝膠狀態(tài)不盡相同，濃度為40 U/ml時凝固速度為2～4 min，濃度為20 U/ml凝固速度變慢，當濃度為10 U/ml時，呈現(xiàn)半凝固狀態(tài)，即使增加凝血酶的體積也不能改變其半凝固狀態(tài)，因此本實驗選擇凝血酶濃度為40 U/ml。

2.2.3 凝血酶滴加體積對抗凝血酶活性測定的影響 每次凝血酶滴加的體積影響凝固穩(wěn)定狀態(tài)，當每次滴加 2．5 μl和 10 μl時，極易出現(xiàn)半凝固狀態(tài)，之后即使再滴加凝血酶也不能改變其半凝固狀態(tài)，因此本實驗凝血酶每次滴加體積為5 μl，凝固狀態(tài)穩(wěn)定。

2.2.4 凝血酶滴加間隔時間對抗凝血酶活性測定的影響 凝血酶不同滴加時間間隔影響凝固穩(wěn)定狀態(tài)，當使用濃度為40 U/ml凝血酶時，滴加時間間隔＜2 min時，可呈現(xiàn)穩(wěn)定的凝固狀態(tài)，隨著時間間隔的增大反而不能增加凝固狀態(tài)的穩(wěn)定性，呈現(xiàn)半凝固狀態(tài)。因此該實驗凝血酶滴加間隔時間＜2 min。

3 討論

地龍為《中國藥典》2015年版收載品種，具有清熱定驚，通絡，平喘，利尿作用，用于高熱神昏，驚癇抽搐，肢體麻木半身不遂等癥，臨床主要用于腦梗死、高血壓等疾病的治療［6］。研究表明地龍?zhí)崛∫壕哂?抗 凝 、 促 纖 溶 和 改 善 血 液 循 環(huán) 等 作 用［8，9］，1983年，Mihara首次從地龍中提取分離出具有抗凝和溶栓活性的蛋白質——蚓激酶，為其抗凝活性物質提供了有利的證據(jù)［10］，同時為含地龍藥品的質量評價和臨床療效提供了資料。有研究建立復方地龍膠囊的質量標準，將其的抗凝血強度值設置為不低于12840 U/g［2］。水蛭是《中國藥典》2015 年版規(guī)定抗凝血活性檢測的中藥材，其抗凝血值不低于 16．0 U/g［6］，因此該文選擇其作為陽性對照。蝮蛇毒是從蝮蛇毒腺中分泌出來的一種毒液，含有多種活性酶及蛋白質，具有多種生物活性和藥理活性，通常被作為抗栓酶使用［3］。人參再造丸中就含有地龍和原蛇毒［6］，具有活血通絡，作用，用于氣虛血瘀，風痰阻絡所致的中風。1981年國內注射用蝮蛇毒劑應用于臨床，但因為毒性大而停止使用［11］。2009年，由尖吻蝮蛇蛇毒提取物研制的藥物“蘇靈”上市，用于治療各種血管栓塞性疾病及預防血栓形成［12］。該制劑不僅含有動物藥地龍，蝮蛇毒，還有活血化瘀作用的植物藥丹參、川芎等，單采用阿魏酸的含量測定作為制劑質量控制的定量標準，無法將制劑質量與活血化瘀，通絡養(yǎng)血的作用聯(lián)系起來。因此，該實驗為復方蝮蛇毒膠囊抗凝血藥理作用與制劑質量標準相關性提供資料，參照《中國藥典》2015年版水蛭的抗凝血酶活性測定實驗進行，分別比較了地龍，蝮蛇毒，地龍+蝮蛇毒，植物藥以及制劑的抗凝活性差異，發(fā)現(xiàn)地龍、蝮蛇毒和制劑的抗凝血活性均顯著高于水蛭，其中以蝮蛇毒抗凝血酶活性最高，超過 160000 U/g，與報道蝮蛇毒在小劑量（0．0004～0．036 ku/kg）時顯示抗凝血活性一致［13］，地龍抗凝血酶活性＞350 U/g。蝮蛇毒與地龍和中藥材混合制成制劑后，其抗凝血酶活性有顯著的降低，原因之一可能是藥物之間的相互作用，降低了其抗凝酶活性；原因之二地龍+蝮蛇毒或者制劑的稱量重量遠遠大于蝮蛇毒（1．08∶0．0144 或 7．2∶0．0144），在計算抗凝血酶活性時擴大了分母數(shù)值，從而使抗凝血酶計算數(shù)值遠小于蝮蛇毒單品，但兩者超強的抗凝血活性特別是蝮蛇毒的抗凝活性完全可以從實驗現(xiàn)象中無法形成穩(wěn)定的凝固狀態(tài)發(fā)現(xiàn)的。此外，該制劑中含有的中藥材成分也有一定的抗凝效果。研究結果表明，其抗凝血酶活性較水蛭要強，接近200 U/g，這些植物藥的抗凝血活性與其文獻報道一致［14］。鑒于制劑中植物藥種類較多而未對單味藥材進行一一比較，植物藥單體成分是否具有抗凝血活性仍有待于進一步研究。

測定抗凝血酶活性時，供試品的濃度，凝血酶的濃度，每次滴加的體積和時間間隔都影響最終凝固狀態(tài)的形成。該實驗供試品的稱量以水蛭抗凝血酶實驗取樣量1 g和患者一天最大制劑服用量為基礎（6粒/次，3次/d），在多次凝血酶反應陽性且狀態(tài)穩(wěn)定的基礎上，最終選擇不同的樣品采用了不同的稀釋倍數(shù)。水蛭為原液，地龍、中藥材和制劑樣品為稀釋20倍，蝮蛇毒單品和蝮蛇毒+地龍樣品稀釋120倍進行實驗計算。在凝血酶選擇40 U/ml，滴加體積為5 μl/次，時間間隔＜2 min時，所有樣品均可以呈現(xiàn)穩(wěn)定的凝固狀態(tài)，重復性好。該實驗表明蝮蛇毒是復方蝮蛇毒膠囊抗凝血酶活性最強的單味藥，其次為地龍，這兩者在本制劑活血化瘀功效中發(fā)揮至關重要的作用，這兩味藥的質量是該制劑質量的關鍵。通過實驗條件摸索和反復測試，三個批號復方蝮蛇毒膠囊樣品抗凝血酶活性平均為333 U/g，因此擬將復方蝮蛇毒膠囊的抗凝血酶活性暫定為≥300.0U/g。

該研究通過復方蝮蛇毒膠囊抗凝血酶活性的研究，建立質量標準與藥理作用相關性評價，彌補了單純以某味藥物的含量測定作為藥品質量控制方法的不足，更有利于對藥品質量的控制；同時，該文對動物單味藥的抗凝血酶活性研究也為動物藥類質量標準的完善提供了資料。