劉盼,雷素娟,何兵,田吉,*
(1.西南醫(yī)科大學藥學院,四川瀘州646000;2.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院,四川瀘州646000)
佛手,為蕓香科植物佛手Citrus medica L.var.sarcodactylis Swingle的干燥成熟果實[1],又稱佛手柑、五指橘、五指柑等。據(jù)《本草綱目》[2]記載,佛手柑“下氣,除心頭痰水;煮酒飲,治痰多咳漱;煮湯,治心下氣痛?!狈鹗炙幨惩矗米魉幉耐?,經(jīng)加工還可制成多種保健食品(如蜜餞、果脯等)及保健飲料(如佛手茶、佛手蜜、佛手酒等)[3]。佛手主要成分為香豆素、黃酮類揮發(fā)油及橙皮苷等[4-6],現(xiàn)代藥理研究表明其具有抗氧化[7]、抗抑郁[8]、祛痰平喘[9]、抗腫瘤及抗HIV活性[10-11]等多種作用。
在中國藥典2015版佛手項下收載了以藥材為對照的薄層鑒別、醇溶性浸出物和橙皮苷的含量測定項,而佛手中的另一類特征性香豆素類化合物卻未得到體現(xiàn)。近年來佛手在國內(nèi)外市場的需求量日益增大,但因藥材種類較多,來源復(fù)雜,造成目前品種混亂、質(zhì)量參差不齊的現(xiàn)象?,F(xiàn)國內(nèi)佛手主流品種為廣佛手(廣州產(chǎn))、川佛手(四川產(chǎn))及金佛手(浙江產(chǎn))[12-13]。四川省合江縣是川佛手的歷史產(chǎn)區(qū),產(chǎn)量曾達到全省15%,是川佛手的重要組成部分。綜合評價合江佛手質(zhì)量,對于川佛手的質(zhì)量控制具有重要意義。為保證臨床用藥的準確性和安全性,提高佛手藥材的質(zhì)量控制標準,以四川合江產(chǎn)佛手為主要研究對象,采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC),同時測定合江佛手中5,7-二甲氧基香豆素、6,7-二甲氧基香豆素的含量,并建立合江佛手的HPLC指紋圖譜。
戴安(P680A)高效液相色譜儀(含四元泵,PDA-100二極管陣列檢測器,TCC-100柱溫箱,Chromeleon色譜工作站):Dionex Softron GmbH;AS7240A超聲清潔機:天津奧特賽恩斯儀器有限公司;XR 205SM-DR電子天平:瑞士Precisa公司。
5,7-二甲氧基香豆素對照品(批號:00003666-2423,經(jīng)HPLC峰面積歸一化法檢測純度在98%以上):美國ChromaDex.Inc;6,7-二甲氧基香豆素對照品(批號:111740-200501,經(jīng)HPLC峰面積歸一化法檢測純度在98%以上):中國藥品生物制品檢定所;乙腈(色譜純):上海星可生化有限公司;水為重蒸餾水。
原料來源見表1,所有原料經(jīng)西南醫(yī)科大學藥學院莊元春副教授鑒定為蕓香科植物佛手Citrus medica L.var.sarcodactylis Swingle的干燥成熟果實。
表1 佛手產(chǎn)地來源Table 1 The source information of FCS
2.1.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗
色譜柱:Besil C18-B(5 μm 250 mm×4.6 mm);流動相:A-乙腈,B-水,梯度洗脫條件:0~11 min,B(55%),11 min~15 min,B(55%~5%),15 min~16 min,B(5%~55%),16 min~22 min,B(55%);流速:1 mL/min;進樣量:10 μL;檢測波長:326 nm;柱溫:30℃。在選定色譜條件下,佛手中5,7-二甲氧基香豆素峰、6,7-二甲氧基香豆素峰與其前后色譜峰的分離度均大于1.5,理論板數(shù)大于4 000。同時取乙腈進樣,結(jié)果表明溶劑無干擾。對照品及樣品色譜圖見圖1。
圖1 對照品(A)及樣品(B)色譜圖Fig.1 Chromatogram of reference substances(A)and sample(B)
2.1.2 供試品溶液的制備
精密稱定佛手樣品1 g,置錐形瓶中,依次加入50 mL、30 mL 75%甲醇,超聲 30 min,放冷過濾,合并兩次濾液,水浴蒸干,殘渣加入乙腈定容至10 mL。
2.1.3 對照品溶液的制備
分別精密稱取5,7-二甲氧基香豆素及6,7-二甲氧基香豆素對照品適量,置10 mL容量瓶中,加乙腈溶解并稀釋至刻度,搖勻即得對照品儲備液(5,7-二甲氧基香豆素:0.534 mg/mL,6,7-二甲氧基香豆素:0.572 mg/mL)。精密量取5,7-二甲氧基香豆素貯備液1 mL及6,7-二甲氧基香豆素貯備液0.1 mL,加乙腈定容到5 mL,即得混合對照品溶液。(每1 mL含6,7-二甲氧基香豆素0.011 44 mg,5,7-二甲氧基香豆素0.106 8 mg)。
2.1.4 線性與范圍
精密量取2.1.3項下2種對照品儲備液,加乙腈制備出6份混合對照品溶液,每1 mL分別含5,7-二甲氧基香豆素 0.013 35、0.026 7、0.053 4、0.106 8、0.213 6、0.427 2 mg,含 6,7-二甲氧基香豆素 0.001 43、0.002 86、0.005 72、0.011 44、0.022 88、0.045 76 mg。分別精密吸取各濃度對照品溶液10 μL進樣,按2.1.1項下方法測定峰面積,以峰面積值A(chǔ)對進樣量C(μg)進行回歸,得出下列標準曲線方程。結(jié)果表明,6,7-二甲氧基香豆素進樣量在 0.014 3 μg~0.457 6 μg 范圍內(nèi),5,7-二甲氧基香豆素進樣量在 0.133 5 μg~4.272 μg范圍內(nèi),與峰面積值線性關(guān)系良好。
6,7-二甲氧基香豆素:A=23.688C+0.070 7,r=0.999 6;
5,7-二甲氧基香豆素:A=71.803C+2.206 8,r=0.999 9。
2.1.5 精密度試驗
精密量取混合對照品溶液(每1 mL含6,7-二甲氧基香豆素 0.01144mg,5,7-二甲氧基香豆素 0.1068mg)10 μL,重復(fù)進樣6次,測定兩香豆素峰面積值。結(jié)果5,7-二甲氧基香豆素與6,7-二甲氧基香豆素RSD分別為0.74%、1.48%,均小于3%,表明儀器精密度良好。
2.1.6 重復(fù)性試驗
取同一批樣品佛手1#,照2.1.2項下方法制備6份供試品溶液,依次進樣10 μL,測定兩香豆素峰面積值并計算含量。結(jié)果5,7-二甲氧基香豆素與6,7-二甲氧基香豆素RSD分別為2.57%、2.72%,均小于3%,表明該方法重復(fù)性良好。
2.1.7 穩(wěn)定性試驗
取同一供試品溶液,室溫放置,分別在 0、1、2、4、8、10、24 h 進樣 10 μL,測定兩香豆素的峰面積值。結(jié)果5,7-二甲氧基香豆素與6,7-二甲氧基香豆素RSD分別2.19%、2.89%,均小于3%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.1.8 加樣回收試驗
精密稱取已知含量的佛手樣品1#(分別含5,7-二甲氧基香豆素及6,7-二甲氧基香豆素0.092%、0.011%)9份,每份約0.5 g,分為三組,每組分別精密添加5,7-二甲氧基香豆素貯備液(0.534 mg/mL)0.7、0.85、1 mL,以及6,7-二甲氧基香豆素對照品儲備液(0.0572mg/mL)1.6、2、2.4 mL,按2.1.2項下方法制備供試品溶液,照2.1.1項下條件進行測定,并以下式計算回收率。試驗結(jié)果表明,本法具有良好的回收率。結(jié)果見表2和表3。
表2 樣品中5,7-二甲氧基香豆素回收率試驗測定結(jié)果(n=9)Table 2 Recoveries of 5,7-dimethoxycoumarin in samples(n=9)
表3 樣品中6,7-二甲氧基香豆素回收率試驗測定結(jié)果(n=9)Table 3 Recoveries of 6,7-dimethoxycoumarin in samples(n=9)
2.1.9 含量測定
取10批合江佛手及其它產(chǎn)地佛手樣品,照2.1.2項下制備供試品溶液。分別精密量取混合對照品溶液和供試品溶液10 μL,照2.1.1項下色譜條件測定,結(jié)果見表4。
表4 含量測定結(jié)果(n=2)Table 4 Content determination(n=2)
續(xù)表4 含量測定結(jié)果(n=2)Continue table 4 Content determination(n=2)
2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗
色譜柱:Besil C18-B(5 μm,250 mm×4.6 mm);流動相:A-乙腈,B-水,梯度洗脫條件:0~20 min,B(85%~30%),20 min~21 min,B(30%~10%),21 min~30 min,B(10%);流速:1 mL/min;進樣量:10 μL;檢測波長:326 nm;柱溫:30℃。在選定色譜條件下,佛手中5,7-二甲氧基香豆素峰與其前后色譜峰的分離度大于1.5,理論板數(shù)大于4 000。
2.2.2 供試品溶液的制備
按照2.1.2項下方法制備供試品溶液。
2.2.3 對照品溶液的制備
精密量取5,7-二甲氧基香豆素對照品儲備液1 mL,置5 mL容量瓶中,加乙腈溶解并稀釋至刻度,搖勻即得(每1 mL含5,7-二甲氧基香豆素0.010 68 mg)。
2.2.4 精密度試驗
取佛手1#制成6份供試品溶液,照2.2.1項下條件連續(xù)進樣6次,測得其共有峰的相對保留時間及相對峰面積RSD均小于3%,表明儀器精密度良好。
2.2.5 重復(fù)性試驗
取佛手1#樣品制成6份供試品溶液,依次進樣10 μL,測得各共有峰的相對保留時間及相對峰面積RSD均小于3%,表明此方法重復(fù)性良好。
2.2.6 穩(wěn)定性試驗
取佛手1#供試品溶液在室溫下依次放置0、1、2、4、8、10、24 h 后進樣 10 μL,照 2.2.1 項下條件進行測定,測得各共有峰的相對保留時間及相對峰面積均小于3%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.2.7 合江佛手指紋圖譜的建立
將10批合江佛手(1#~10#)指紋圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.130723版本),選擇S10為參照圖譜,時間窗寬度為0.1,以5,7-二甲氧基香豆素峰為參照(S)進行多點校正,并生成合江佛手藥材原料指紋對照圖譜。見圖2、圖3。
圖2 5,7-二甲氧基香豆素對照品(A)及10批合江佛手原料(B)指紋圖譜Fig.2 Fingerprint of reference substance(A)and 10 batches of FCS from Hejiang(B)
圖3 合江佛手藥材原料對照指紋圖譜Fig.3 Reference fingerprint of FCS from Hejiang
2.2.8 共有峰的標定
采用相對保留時間標定共有峰。據(jù)《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》規(guī)定:單峰面積占總峰面積小于10%的共有峰,峰面積比值不作要求,但必須標定相對保留時間。10批合江佛手指紋圖譜中除5,7-二甲氧基香豆素參照峰外,其余峰面積均較小,不足總峰面積的10%,故僅標定共有峰的相對保留時間。將合江佛手原料的指紋圖譜進行匹配后,得12個共有峰,以5,7-二甲氧基香豆素色譜峰(S峰)的保留時間為1,計算各共有峰的相對保留時間。見表5。
表5 各共有峰相對保留時間Table 5 Relative retention time of common peaks
2.2.9 相似度計算
將10批合江佛手色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012.130723版本)進行自動匹配,生成對照圖譜,系統(tǒng)將每批原料與對照圖譜進行相似度計算。另依次導(dǎo)入其余產(chǎn)地佛手指紋圖譜,以合江佛手原料對照指紋圖譜為參照圖譜,計算其余產(chǎn)地佛手與其的相似度。結(jié)果見表6、表7。
表6 合江佛手相似度Table 6 Similarity results of FCS from Hejiang
表7 不同產(chǎn)地佛手與合江佛手相似度Table 7 Similarity results of FCS in different areas
已有的研究對廣佛手,金佛手的報道較多,從成分分析、含量測定到指紋圖譜均有涉及[14-18],而川佛手研究相對較少,合江佛手的質(zhì)量標準及指紋圖譜研究目前還未見報道。中藥指紋圖譜具有整體性與模糊性的特點,本文采用HPLC法,將含量測定與指紋圖譜兩種分析方法相結(jié)合,即定量與定性的結(jié)合,能更全面地評價合江佛手,為其栽培和質(zhì)量控制提供可靠依據(jù)。
佛手中香豆素的主要成分為5,7-二甲氧基香豆素[16],故選擇其作為含量測定的對照品和指紋圖譜的S峰。10批合江佛手的含量測定結(jié)果表明,5,7-二甲氧基香豆素的含量在0.059%~0.093%之間,變動幅度不大,可以作為佛手的含量測定指標,而6,7-二甲氧基香豆素含量在0%~0.006 4%之間,含量太低,變動較大,可為佛手質(zhì)量提供參考,但不宜作為質(zhì)控指標。各產(chǎn)地5,7-二甲氧基香豆素的含量有較明顯的差異,合江產(chǎn)地含量較高,云南產(chǎn)地含量較低,6,7-二甲氧基香豆素因變動較大看不出明顯差異。
10批合江佛手原料與對照圖譜的相似度均在0.9以上,說明各批樣品之間差異不明顯,質(zhì)量較穩(wěn)定。各產(chǎn)地佛手與合江佛手間有顯著的差異,其中浙佛手與之相似度最低,為0.623~0.690;兩川產(chǎn)佛手(沐川、石棉)及廣佛手與合江佛手相似度相對較高,表明建立的指紋圖譜具有一定的代表性與實用性。
以5,7-二甲氧基香豆素,6,7-二甲氧基香豆素進樣,采用二極管陣列檢測器掃描,選擇了205、326、350 m 3個波長測定,結(jié)果在326 nm波長下峰形和分離度較好,故檢測波長選擇326 nm。
曾考察了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水等體系,經(jīng)反復(fù)優(yōu)化調(diào)整后采用梯度洗脫條件,乙腈-水作為流動相的色譜圖分離效果最佳。
試驗曾考察了不同濃度甲醇(25%、50%、75%、100%)的提取效果,在提取方式方面比較了超聲、回流提取及氯仿萃取等,最終發(fā)現(xiàn)以75%甲醇超聲提取兩次,每次30 min的樣品溶液峰面積較高且峰形較好。試驗還發(fā)現(xiàn)浸泡時間對提取率幾無影響。