李青 賴榮陶 盧捷 李自強(qiáng) 謝青 王暉 郭清

慢性乙型肝炎(CHB)感染可能進(jìn)展為肝硬化和肝衰竭，是導(dǎo)致肝細(xì)胞癌(HCC)的主要原因[1]。監(jiān)測HBV DNA復(fù)制是治療相關(guān)肝病和降低發(fā)病率和死亡率的主要臨床問題。

SUMO化修飾作用廣泛，例如細(xì)胞信號傳導(dǎo)，細(xì)胞周期，轉(zhuǎn)錄或致癌[2]。SUMO化修飾是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，被SUMO化修飾的蛋白也可以被SUMO特異性蛋白酶家族(SENP)去SUMO[3]。作為SENP的關(guān)鍵成員，SENP3特異性地解偶聯(lián)SUMO2或SUMO3，可在細(xì)胞應(yīng)激后迅速增加，例如，氧化應(yīng)激或高血糖應(yīng)激[4-5]。上調(diào)的SENP3可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增殖和癌癥轉(zhuǎn)移。然而，SENP3和SENP3相關(guān)分子是否參與HBV DNA復(fù)制目前尚不清楚。因此，本研究探索SENP3及相關(guān)蛋白在HBV DNA復(fù)制中的作用。

資料和方法

一、材料

HBV DNA PCR檢測試劑盒(達(dá)安)、全自動(dòng)脫水機(jī)(ASP300)、石蠟包埋機(jī)(EG1150C)、脫蠟機(jī)(Autotainer XL)等均來自于德國Leica公司；實(shí)時(shí)PCR 試劑(Takara)，7500型 PCR 儀購于(美國)ABI公司；DMEM，F(xiàn)BS，PBS(pH7.2)購自(美國)Gibco公司；SENP3、Akt、p-Akt、β-actin一抗及羊抗兔二抗購自(美國)CST公司；PCDNA3.1、RHSENP3質(zhì)粒由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院易靜課題組贈(zèng)送；HBV轉(zhuǎn)基因小鼠購于上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；SENP3的SiRNA及對照購自廣州銳博生物科技有限公司。

二、方法

(一)細(xì)胞培養(yǎng) HepG2、HepG2.215細(xì)胞用含有10% FBS和90%的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37℃，體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2和適宜濕度的孵箱。

(二)人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離及總蛋白提取 PBS稀釋患者外周血，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞， 計(jì)數(shù)，用含SDS上樣緩沖液裂解PBMC，充分震蕩，100 ℃水浴5 min，冰浴5 min，反復(fù)3次，12 000 r/min離心5 min，提取上清液，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(三)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HepG2.2.15細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6孔板中，RHSENP3質(zhì)粒組設(shè)兩個(gè)濃度100 ng和500 ng，對照組為PcDNA3.1空載質(zhì)粒。待細(xì)胞生長融合達(dá)70%～80%后，用100 μL opti-DMEM分別稀釋100 ng RHSENP3+400 ng pcDNA3.1、500 ng RHSENP3、500 ng pcDNA3.1質(zhì)粒和5 μL Lipo 2 000，顛倒混勻，室溫放置15 min，然后逐滴加入HepG2.2.15細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞提取總蛋白，方法如上，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

(四)SENP3 siRNA轉(zhuǎn)染 HepG2.2.15細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6孔板中，設(shè)NC組、Si-RNA組。待細(xì)胞生長融合達(dá)60%～70%后，NC組、si-RNA組按lipo2 000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48 h后收集細(xì)胞，提取總蛋白，方法如上，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

(五)實(shí)時(shí)PCR 檢測 使用SYBR○RPremix Ex TaqTM II(Takara，Dalian，China)和ABI 7500儀器(Applied Biosystems，USA)，對SENP3進(jìn)行擴(kuò)增。以gapdh為參考基因，應(yīng)用2-ΔΔCt方法計(jì)算mRNA的相對表達(dá)水平。采用達(dá)安基因公司的HBV DNA PCR試劑盒檢測待測樣品的HBV DNA載量。

(六)蛋白質(zhì)印跡 用細(xì)胞裂解液裂解PBMC、小鼠肝組織細(xì)胞、HepG2、HepG2.2.15細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。BCA法測得蛋白含量。按每個(gè)樣本50 μg的蛋白質(zhì)上樣，SDS-PAGE電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜，4% BSA封閉，一抗、二抗孵育，洗滌后，ECL試劑盒在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)發(fā)光檢測。

(七)免疫組織化學(xué)染色 小鼠肝組織用40 g/L多聚甲醛，4℃固定過夜，制作石蠟切片，常規(guī)切片后，脫蠟；30 mL/L H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，50 g/L BSA 室溫封閉20 min，兔抗SENP3抗體4℃孵育過夜；洗滌后，加二抗，37℃孵育2 h。加顯色劑20 min，核固紅復(fù)染，封片后觀察。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，GraphPad Prism 5. 0軟件進(jìn)行繪圖。兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、 HBV DNA載量與其PBMC中SENP3的含量呈反比

兩例患者HBV DNA經(jīng)干擾素治療后明顯降低，分別從3×106IU/mL及4.6×104IU/mL降至<500 IU/mL。而外周血中SENP3蛋白含量顯著升高，其含量分別是未經(jīng)治療時(shí)的5.6倍和2.1倍，Akt的磷酸化水平降低，含量分別是未經(jīng)治療時(shí)的23.5%和48.7%，見圖1A。與5名健康人相比，7例CHB患者PBMC中SENP3蛋白含量顯著降低。經(jīng)灰度定量分析，健康組PBMC中SENP3的蛋白含量是CHB患者的7.4倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1B。

圖1 患者PBMC中及HepG2、HepG2.2.15細(xì)胞中

二、 HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中SENP3的表達(dá)

與對照組小鼠相比，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中SENP3表達(dá)顯著降低(圖2)；HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織中磷酸化的Akt含量顯著升高，其灰度值平均是對照組的4.1倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

圖2 HBV轉(zhuǎn)基因小鼠與對照組小鼠肝組織中SENP3的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色 低倍放大)

圖3 HBV轉(zhuǎn)基因小鼠與對照組小鼠肝組織中Akt、p-Akt的表達(dá)

三、SENP3和Akt磷酸化水平在HepG2中的表達(dá)

SENP3在HBV DNA全基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HepG2受體細(xì)胞(HepG2.2.15)中表達(dá)量顯著低于未轉(zhuǎn)染HBV DNA的HepG2細(xì)胞，AKT磷酸化水平顯著增高(見圖4A)。

四、 SENP3通過抑制HepG2.2.15細(xì)胞中AKT的磷酸化，從而抑制HBV DNA的復(fù)制

在RHSENP3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染100 ng組和500 ng組中，p-AKT的含量分別是對照組(空載質(zhì)粒)的32.6%和14.8%(P<0.01)，說明SENP3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染濃度越高，Akt磷酸化水平越低(圖4B)；當(dāng)給HepG2.2.15細(xì)胞轉(zhuǎn)染100 ng SENP3質(zhì)粒，細(xì)胞中HBV DNA含量由對照組中的7.983.03×106IU/mL降低至3.45×106IU/mL(P<0.01)，若在HepG2.2.15細(xì)胞轉(zhuǎn)染500 ng SENP3質(zhì)粒，細(xì)胞中HBV DNA減少至1.92×106IU/mL(P<0.01)；若使用siRNA干擾HepG2.2.15細(xì)胞中SENP3的表達(dá)，則Akt磷酸化程度顯著升高，平均是對照組細(xì)胞中的5.6倍(P<0.01)(圖4C)。以上結(jié)果提示，SENP3是通過抑制肝細(xì)胞中Akt的磷酸化水平來抑制HBV DNA復(fù)制。

討 論

本研究觀察到CHB患者PBMC中和HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中的SENP3蛋白含量均顯著降低。在體外實(shí)驗(yàn)?zāi)MHBV感染的細(xì)胞模型HepG2.215中，SENP3含量亦顯著降低，SENP3相應(yīng)的mRNA水平也被證實(shí)顯著降低。這些數(shù)據(jù)表明SENP3在HBV感染發(fā)展過程中有明確的作用。已經(jīng)證實(shí)，HepG2.2.15細(xì)胞中大量被磷酸化的Akt可因SENP3過表達(dá)而減弱，相應(yīng)的HepG2.2.15細(xì)胞中HBV DNA的復(fù)制被抑制。說明SENP3能通過抑制Akt磷酸化來抑制HBV DNA的復(fù)制。然而，HBV患者肝細(xì)胞內(nèi)SENP3含量與HBV DNA載量之間的相關(guān)性缺乏可靠的證據(jù)。

圖4 HepG2、HepG2.2.15細(xì)胞中SENP3、Akt及p-AKT的表達(dá)

已有研究表明，miR-99家族可通過IGF-1R/PI3K/Akt/mTOR/ULK1信號通路誘導(dǎo)肝細(xì)胞自噬，促進(jìn)HBV復(fù)制[6]；此外HBcAg通過激活A(yù)kt，ERK和P38信號通路誘導(dǎo)B7-H1上調(diào)，從而抑制HBV DNA的清除和減低樹突細(xì)胞數(shù)量，HBX蛋白可通過與PI3K的催化亞基相結(jié)合促進(jìn)85位點(diǎn)的磷酸化，活化的PI3K也間接的促進(jìn)了下游AKT的活化[7-8]。以上結(jié)果表明，AKT信號通路參與了調(diào)控HBV DNA復(fù)制的過程，SENP3是調(diào)控AKT磷酸化的重要因子。

總之，SENP3在CHB患者和體內(nèi)動(dòng)物模型以及體外HBV肝細(xì)胞模型中下調(diào)。此外，SENP3能通過抑制Akt磷酸化而抑制HBV DNA的復(fù)制。這些數(shù)據(jù)提示SENP3被用作治療HBV的潛在治療靶點(diǎn)的可能性。