何 欣 ，劉鳳磊 ，王 濤 ，李曉琴 ，劉 瑋

（1.甘肅省腫瘤醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅 蘭州 730050）

乳腺癌是具有高度異質(zhì)性的腫瘤，2013年ST.Gallen乳腺共識(shí)基于免疫組化染色對(duì)乳腺癌進(jìn)行了分型，分為L(zhǎng)uminal A-like型、Luminal B-like型、HER-2陽(yáng)性型及三陰性型。三陰性乳腺癌（TNBC）即雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）及人表皮生長(zhǎng)因子受體（HER-2）均為陰性表達(dá)[1-3]，因其基因表型的異質(zhì)性，導(dǎo)致其組織學(xué)形態(tài)、治療反應(yīng)和預(yù)后均同其他類型有明顯差異[4-6]。

細(xì)胞間黏附分子（Inter Cellular Adhesion Molecule-1，ICAM-1）又稱CD54，是免疫球蛋白超家族中一種重要的細(xì)胞黏附分子[7]，它的作用是介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)間的相互結(jié)合，從而參與腫瘤細(xì)胞血管生成以及侵襲和轉(zhuǎn)移，與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為密切相關(guān)[8]。研究發(fā)現(xiàn)，ICAM-1在許多惡性腫瘤中高表達(dá)，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7-9]。

Ki-67是細(xì)胞增殖的相關(guān)抗原，在增殖細(xì)胞核中表達(dá)，主要用于判斷細(xì)胞的增殖活性，在所有活動(dòng)的細(xì)胞周期（G1、S、G2和有絲分裂期）中表達(dá)，而在G0期不表達(dá)。Ki-67增殖指數(shù)高低與許多腫瘤的分化程度、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移以及預(yù)后密切相關(guān)，也是惡性腫瘤預(yù)后的重要參考指標(biāo)之一[10]。在三陰性乳腺癌中，Ki-67指數(shù)的預(yù)后價(jià)值并不十分明確。

本研究通過(guò)免疫組化回顧性檢測(cè)ICAM-1、Ki-67蛋白在72例三陰性乳腺癌組織及40例非三陰性乳腺癌組織中的表達(dá)，并持續(xù)跟蹤隨訪，探討其表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，以期為三陰性乳腺癌的個(gè)體化治療提供更多信息。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

（1）收集甘肅省腫瘤醫(yī)院2011—2013年收治的乳腺癌患者，經(jīng)穿刺活檢或外科手術(shù)切除，病理結(jié)果確診為浸潤(rùn)性乳腺癌標(biāo)本。患者均為女性，其中三陰性乳腺癌標(biāo)本72例，患者年齡30～77歲，中位年齡52歲；腫瘤大?。海? cm的29例，≥2 cm且≤5 cm的41例，＞5 cm的2例；浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌58例，浸潤(rùn)性小葉癌1例，其他病理分型13例。非三陰性乳腺癌標(biāo)本40例。所有標(biāo)本經(jīng)4%中性甲醛溶液固定后，常規(guī)石蠟包埋。

（2）所有三陰性乳腺癌患者均進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間22～74個(gè)月，中位隨訪時(shí)間62個(gè)月，其中死亡15例，5年生存率為79.17%。6例病人失訪或死于其他疾病。

1.2 方法

通過(guò)粗針穿刺的方式于化療前收集接受新輔助化療的乳腺癌患者的癌組織標(biāo)本，對(duì)于未接受新輔助化療的乳腺癌患者，則是在根治手術(shù)后收集癌組織標(biāo)本。三陰性乳腺癌組織病例是通過(guò)免疫組化染色選擇ER、PR、Her-2均為陰性以及免疫組化染色Her-2為1+或2+而FISH檢測(cè)無(wú)Her-2基因擴(kuò)增的病例。

ICAM-1兔抗人單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司（貨號(hào)ab53013），Ki-67抗體購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，應(yīng)用免疫組化檢測(cè)ICAM-1蛋白的表達(dá)，具體操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判讀

所有免疫組化片均由兩位副高以上病理醫(yī)師獨(dú)立雙盲觀察判讀，ICAM-1蛋白在細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中著色，判定標(biāo)準(zhǔn)采用陽(yáng)性細(xì)胞比例和著色深淺相結(jié)合的方法，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，細(xì)胞數(shù)≤25%計(jì)1分，25%～50%計(jì)2分，＞50%計(jì)3分；顯微鏡下無(wú)著色計(jì)0分，著色為淺黃顆粒計(jì)1分，深黃或棕色顆粒計(jì)2分。最后兩者所得評(píng)分相乘，0分和1分為陰性表達(dá)，2、3、4和6分為陽(yáng)性表達(dá)。Ki-67蛋白表達(dá)于細(xì)胞核，選取至少5個(gè)表達(dá)最高的代表性高倍視野（熱點(diǎn)區(qū)），根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例計(jì)算陽(yáng)性率。按照2013年St.Gallen會(huì)議共識(shí)，Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞＜14%定義為低表達(dá)，Ki-67≥14%定義為高表達(dá)[1，11]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，兩獨(dú)立樣本組間比較采用χ2檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法，并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 三陰性乳腺癌、非三陰性乳腺癌組織中ICAM-1的表達(dá)

ICAM-1表達(dá)于腫瘤細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中（見(jiàn)圖1），40例非三陰性乳腺癌組織中ICAM-1的陽(yáng)性表達(dá)率為32.50%（13/40），72例三陰性乳腺癌組織ICAM-1的陽(yáng)性表達(dá)率為68.06%（49/72），兩者比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.145，P＜0.05）。見(jiàn)表1。

圖1 免疫組化標(biāo)記ICAM-1蛋白在TNBC中的表達(dá)情況

表1 ICAM-1在三陰性乳腺癌、非三陰性乳腺癌中的表達(dá)

2.2 Ki-67在三陰性乳腺癌組織和非三陰性乳腺癌組織中的表達(dá)

72例三陰性乳腺癌組織中，Ki-67的高表達(dá)率為88.89%（64/72）；40例非三陰性乳腺癌組織中，Ki-67的高表達(dá)率為70.00%（28/40）。三陰性乳腺癌組織中Ki-67高表達(dá)率明顯高于非三陰性乳腺癌組織（P＜0.05），見(jiàn)表 2。

2.3 ICAM-1蛋白的表達(dá)與三陰性乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

表2 三陰性乳腺癌和非三陰性乳腺癌組織中Ki-67的陽(yáng)性表達(dá)

ICAM-1表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、脈管癌栓、神經(jīng)侵犯無(wú)關(guān)（P＞0.05），但與組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、Ki-67高表達(dá)相關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表 3。

表3 ICAM-1在三陰性乳腺癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（人）

2.4 Ki-67在三陰性乳腺癌組織中高表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

Ki-67高表達(dá)率與患者年齡、脈管癌栓、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期無(wú)關(guān)（P＞0.05），但與腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)相關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表 4。

2.5 ICAM-1蛋白的表達(dá)與三陰性乳腺癌5年生存率的關(guān)系

Kaplan-Meier生存分析顯示：49例三陰性乳腺癌ICAM-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)組患者的5年生存率為71.4%（35/49），23例三陰性乳腺癌ICAM-1蛋白陰性表達(dá)組的5年生存率為95.7%（22/23）；三陰性乳腺癌患者中，ICAM-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)組的5年生存率顯著低于ICAM-1蛋白陰性表達(dá)組（P=0.027）。見(jiàn)圖2。

2.6 Ki-67蛋白表達(dá)與三陰性乳腺癌5年生存率的關(guān)系

Kaplan-Meier生存分析顯示：三陰性乳腺癌患者中，Ki-67蛋白低表達(dá)組患者的5年生存率為100.0%（8/8），Ki-67蛋白高表達(dá)組患者的5年生存率為76.6%（49/64），Ki-67蛋白高表達(dá)患者的5年生存率下降明顯，但與Ki-67蛋白低表達(dá)組的5年生存率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.145）。見(jiàn)圖3。

3 討論

3.1 ICAM-1的功能及其與部分腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性研究

表4 Ki-67在三陰性乳腺癌組織中表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（人）

圖2 ICAM-1蛋白低表達(dá)組與ICAM-1蛋白高表達(dá)組三陰性乳腺癌患者的5年生存率比較

圖3 Ki-67蛋白低表達(dá)組與Ki-67蛋白高表達(dá)組三陰性乳腺癌患者的5年生存率比較

乳腺癌是一類異質(zhì)性明顯的惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展是個(gè)多基因、多步驟、多階段的過(guò)程。近年來(lái)，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)和分子生物學(xué)的發(fā)展，乳腺癌標(biāo)志物的研究日益成為熱點(diǎn)。三陰性乳腺癌因?qū)?nèi)分泌治療和Herceptin靶向治療效果欠佳、預(yù)后差、易復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，對(duì)于其分子標(biāo)志物的研究越來(lái)越受到研究者的關(guān)注。

細(xì)胞間黏附分子（ICAM-1）又稱 CD54，是免疫球蛋白超家族中重要的細(xì)胞黏附分子[7]。黏附分子分為五大類，包括鈣黏附素家族、整合素家族、選擇素家族、免疫球蛋白超家族和透明質(zhì)酸黏素[12]，ICAM-1編碼人類的基因定位于第19號(hào)染色體上，包括6個(gè)內(nèi)含子和7個(gè)外顯子[13]，該蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為80～110 KD，主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞表面，與淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1（LFA1）相結(jié)合，在正常組織結(jié)構(gòu)的維持、炎癥與免疫應(yīng)答、傷口修復(fù)、凝血與血栓形成以及腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等多種生理、病理過(guò)程中均具有重要作用[14]。ICAM-1在人類正常乳腺、大腦、結(jié)腸、食管、腎、肝、卵巢、胰腺、前列腺、直腸、皮膚、小腸、宮頸組織表達(dá)缺失，但在正常脾臟、肺、淋巴結(jié)、胸腺、睪丸和骨組織中陽(yáng)性表達(dá)[2]。ICAM-1在腫瘤學(xué)中的作用正在研究中，它在部分腫瘤中表達(dá)上調(diào)，與疾病進(jìn)展、預(yù)后差、抵抗化療有關(guān)[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，ICAM-1在許多惡性腫瘤中高表達(dá)，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7-9]。

3.2 ICAM-1與Ki-67蛋白在乳腺癌中的表達(dá)及其與三陰性乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

本研究應(yīng)用免疫組化檢測(cè)ICAM-1蛋白在72例三陰性乳腺癌組織、40例非三陰性乳腺癌組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三陰性乳腺癌組織中ICAM-1陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于非三陰性乳腺癌組織（P＜0.05）。進(jìn)一步對(duì)ICAM-1蛋白表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性分析顯示，ICAM-1表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、脈管癌栓、神經(jīng)侵犯無(wú)關(guān)（P＞0.05），但與組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、Ki-67高表達(dá)相關(guān)（P＜0.05）。此外，本研究中Kaplan-Meier生存分析顯示：ICAM-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)組患者的5年生存率顯著低于ICAM-1蛋白陰性表達(dá)組（P＜0.05）。此結(jié)果提示，三陰性乳腺癌的惡性程度較高，臨床預(yù)后較差，且ICAM-1的表達(dá)與三陰性乳腺癌患者的惡性生物學(xué)行為及生存關(guān)系密切。

我們同時(shí)應(yīng)用免疫組化檢測(cè)Ki-67蛋白在72例三陰性乳腺癌組織及40例非三陰性乳腺癌組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三陰性乳腺癌組織中Ki-67高表達(dá)率明顯高于非三陰性乳腺癌組織（P＜0.05），提示三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖活躍。對(duì)Ki-67蛋白表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性分析顯示，Ki-67高表達(dá)率與腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)相關(guān)（P＜0.05），但與患者年齡、脈管癌栓、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期無(wú)關(guān)（P＞0.05）。Ki-67是細(xì)胞增殖的相關(guān)抗原，在增殖細(xì)胞核中表達(dá)，主要用于判斷細(xì)胞的增殖活性，說(shuō)明癌細(xì)胞有絲分裂期越活躍，其體積越大、組織分級(jí)越高。Kaplan-Meier生存分析顯示：Ki-67蛋白低表達(dá)組患者的5年生存率為100.0%，Ki-67蛋白高表達(dá)組患者的5年生存率為76.6%，Ki-67蛋白高表達(dá)患者的5年生存率下降明顯，此結(jié)果對(duì)于判斷及預(yù)測(cè)三陰性乳腺癌患者預(yù)后有一定價(jià)值，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.145），可能是由于本次Ki-67蛋白低表達(dá)組患者樣本量較少（僅8例），有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。

3.3 ICAM-1、Ki-67蛋白在三陰性乳腺癌患者預(yù)后判斷及治療中的可能作用

通過(guò)本研究我們認(rèn)為，ICAM-1、Ki-67蛋白在三陰性乳腺癌組織中呈高表達(dá)，且ICAM-1、Ki-67高表達(dá)與三陰性乳腺癌患者的惡性生物學(xué)行為及生存關(guān)系密切，提示ICAM-1、Ki-67蛋白有可能成為三陰性乳腺癌患者預(yù)后判斷的重要指標(biāo)。同時(shí)，ICAM-1有望成為TNBC治療的新靶點(diǎn)，改變TNBC治療只能依靠單純性化療的現(xiàn)狀，并為其早期診斷及靶向治療提供一定的依據(jù)。