陳益明 盧莎 連結(jié)靜 梅瑾 顧琳媛 張艷珍 張聞 褚雪蓮 王昊 王敏

唐氏綜合征（Down’s syndrome，DS）又稱 21-三體綜合征、先天愚型，是新生兒出生缺陷常見的一類遺傳性疾病，是第21號(hào)染色體比正常人多出一條而導(dǎo)致以智力發(fā)育障礙為主要特征的綜合征[1-2]。產(chǎn)前篩查是指通過簡便、經(jīng)濟(jì)和較少創(chuàng)傷的檢測方法，從母體血清中篩查胎兒患DS的風(fēng)險(xiǎn)性[3]，目前多采用中孕期母血清中甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）、游離人絨毛膜促性腺激素β亞基（freeβsubunitofhumanchorionicgonadotropin，free β-HCG）、游離雌三醇（unconjugated Estradiol，uE3）等標(biāo)志物進(jìn)行篩查[4-5]。AFP 作為 DS 產(chǎn)前篩查中主要標(biāo)志物之一已經(jīng)在各地常規(guī)開展，但檢測靈敏度均較低[6]。血清中AFP與小扁豆素（lensculinaris agglutinin，LCA）結(jié)合后，經(jīng)電泳分成三帶，依次命名為 AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3，即 LCA 非結(jié)合型（AFP-L1、AFP-L2）和 LCA 結(jié)合型（AFP-L3）[7]。通常把與LCA結(jié)合的不同構(gòu)型的AFP稱為AFP異質(zhì)體，它是新一代的腫瘤標(biāo)志物[8]。有研究表明AFP-L2或AFP-L3在篩查DS方面優(yōu)于AFP[9-10]，但有關(guān)AFP-L2和AFPL3聯(lián)合篩查DS方面的報(bào)道較少，因此，筆者選擇61例健康胎兒孕婦和88例產(chǎn)前診斷為DS胎兒的孕婦作為研究對(duì)象，探討母血清AFP-L2和AFP-L3水平與DS胎兒之間的關(guān)系及聯(lián)合篩查的效能情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 回顧2007年10月至2016年9月來自杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院（杭州市婦幼保健院）366 355例和杭州市余杭區(qū)婦幼保健院96 943例共2家產(chǎn)前篩查中心產(chǎn)前門診、妊娠15～20+6周的單胎孕婦463 298例。根據(jù)孕婦妊娠結(jié)局有無胎兒DS將研究對(duì)象分為病例組和對(duì)照組，病例組為經(jīng)羊水細(xì)胞染色體核型分析確診為DS胎兒的孕婦88例，對(duì)照組為隨機(jī)抽取同時(shí)期胎兒發(fā)育正常的孕婦61例。兩組孕婦的年齡、孕期及體重比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。

表1 兩組孕婦一般資料的比較

1.2 診斷和排除標(biāo)準(zhǔn) 病例診斷依據(jù)中國出生缺陷監(jiān)測網(wǎng)制訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)[11-12]，其主要特征如下：（1）眼距寬（＞2.5cm）；（2）塌鼻；（3）外眥上斜；（4）全身肌張力低；（5）雙側(cè)或單側(cè)通貫手和（或）高位三叉點(diǎn)t；（6）小指短小，其中節(jié)短或缺如；（7）Ⅰ、Ⅱ趾距寬（草鞋足）；（8）拇趾球部脛側(cè)弓狀紋；（9）低位耳。以上特征中有5項(xiàng)組合再結(jié)合其他特點(diǎn)可初步篩查為DS，確診需作染色體檢查。染色體分析：以核型47，XX（或XY）+21最常見，占94%～95%；1%～2%為 21-三體嵌合型；2%～3%為易位型，包括D/G易位和G/G易位。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）雙胎、多胎妊娠；（2）合并其他內(nèi)科疾病如胰島素依賴性糖尿病及嚴(yán)重妊娠并發(fā)癥；（3）吸煙；（4）試管嬰兒；（5）隨訪結(jié)果為18-三體、13-三體、神經(jīng)管缺陷以及其他出生缺陷；（6）資料信息不全者；（7）孕婦信息與血清標(biāo)本不匹配者。

1.3 方法

1.3.1 試劑和儀器 2家篩查中心統(tǒng)一使用1235 Auto DELFIA自動(dòng)時(shí)間分辨熒光免疫分析儀（美國Perkin Elmer公司）進(jìn)行產(chǎn)前篩查檢測，配套雙標(biāo)記試劑盒（AFP/free β-HCG）、增強(qiáng)液、洗液、質(zhì)標(biāo)品和標(biāo)準(zhǔn)品（美國Perkin Elmer公司）；采用 RT-6100酶標(biāo)儀（美國Rayto公司），988洗板機(jī)（北京 Tianshi公司），AFP-L2（美國BIM公司）和AFP-L3試劑（美國BIM公司）。

1.3.2 檢測方法 抽取空腹外周靜脈血2～3ml，30min后分離血清標(biāo)本并保存于2～8℃冰箱，于1周內(nèi)送檢，產(chǎn)前篩查指標(biāo)為AFP和free β-HCG。產(chǎn)前篩查檢測結(jié)束后多余血清標(biāo)本儲(chǔ)存于-80℃冰箱保存。累積到一定數(shù)量后集中檢測AFP-L2和AFP-L3水平，檢測前將病例組和對(duì)照組的信息資料與儲(chǔ)存的血清標(biāo)本進(jìn)行匹配，并將血清標(biāo)本進(jìn)行低溫離心混勻和批量檢測，應(yīng)用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）分別檢測AFP-L2和AFP-L3水平。

1.4 妊娠結(jié)局隨訪 每例篩查對(duì)象均在新生兒出生前后進(jìn)行三級(jí)網(wǎng)絡(luò)隨訪，對(duì)孕期發(fā)生自然流產(chǎn)、死胎或死產(chǎn)的胎兒進(jìn)行相關(guān)檢查以確診，并對(duì)新生兒進(jìn)行常規(guī)體格檢查。按照《中國出生缺陷監(jiān)測方案》填報(bào)《出生缺陷兒登記卡》，出生缺陷診斷按國際疾病分類標(biāo)準(zhǔn)（ICD-10）進(jìn)行分類診斷。

1.5 風(fēng)險(xiǎn)估計(jì) DS的風(fēng)險(xiǎn)值通過將DS的年齡風(fēng)險(xiǎn)值與對(duì)應(yīng)正態(tài)分布似然比值相乘計(jì)算[13]，年齡風(fēng)險(xiǎn)值計(jì)算方程取自Cuckle等[14]研究結(jié)果。建立不同模型對(duì)DS篩查效能進(jìn)行比較，通過AFP-L2、AFP-L3多指標(biāo)以建立模型形式對(duì)DS篩查效能比較分析，使用AFP-L2、AFPL3構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)計(jì)算模型相比于原單獨(dú)使用AFP MoM值作為單截?cái)嗟姆绞接懈玫暮Y查效能。AFP-L2、AFP-L3的MoM值服從多元正態(tài)分布f（AFP-L2 MoM，AFP-L3 MoM），按照風(fēng)險(xiǎn)計(jì)算模型的建模方法，可以計(jì)算得出各指標(biāo)分布的對(duì)應(yīng)參數(shù)，模型通過計(jì)算分布似然比作為DS風(fēng)險(xiǎn)[13]。使用相同的原理分別構(gòu)建四個(gè)模型：模型一：AFP+free β-HCG；模型二：AFP-L2+free β-HCG；模型三：AFP-L3+free β-HCG；模型四：AFP-L2+AFP-L3+free β-HCG。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，正態(tài)性檢驗(yàn)采用One-sample Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)，正態(tài)分布的計(jì)量資料以 表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。ROC曲線與最佳切值計(jì)算[15]，并計(jì)算AFP-L2和AFP-L3的最佳臨界值、AUC、靈敏度、特異度、約登指數(shù)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組孕婦血清AFP-L2、AFP-L3水平比較 DS組孕婦血清AFP-L2高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；DS組孕婦血清AFP-L3高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表 2。

表2 兩組孕婦血清AFP-L2、AFP-L3水平比較

2.2 AFP-L2和AFP-L3單獨(dú)篩查DS胎兒的價(jià)值 AFPL2 篩查 DS 胎兒的 AUC=0.891（95%CI∶0.841～0.941），P＜0.01。根據(jù)ROC曲線計(jì)算出AFP-L2篩查DS胎兒的最佳臨界值為6.24 ng/ml，其靈敏度、特異度、約登指數(shù)分別為：0.721、1.000、0.721；AFP-L3 篩查 DS 胎兒的AUC=0.824（95%CI：0.756～0.891），P＜0.01。AFP-L3 篩查DS胎兒的最佳臨界值為1.75ng/ml，其靈敏度、特異度、約登指數(shù)分別為：0.663、0.967、0.627。見圖 1。

2.3 AFP-L2和AFP-L3聯(lián)合篩查DS胎兒的效能 不同建模方式結(jié)果比較，以AFP-L2+AFP-L3+free β-HCG篩查 DS 胎兒的 AUC 最高=0.929（95%CI：0.861～0.975），P＜0.01。最佳臨界值為1/1 636時(shí)，此時(shí)的靈敏度、特異度、約登指數(shù)分別為：0.907、0.857、0.764，不同建模 AUC的高低順序是以AFP-L2+AFP-L3+free β-HCG＞AFPL2+free β-HCG＞AFP-L3+free β-HCG＞AFP+free β-HCG，見表3和圖2。

圖1 AFP-L2、AFP-L3等單項(xiàng)指標(biāo)篩查DS的ROC曲線

表3 AFP、AFP-L2、AFP-L3單獨(dú)篩查和聯(lián)合篩查DS效能分析

3 討論

目前DS產(chǎn)前篩查方法，一般是采用AFP+free β-HCG二聯(lián)法篩查或AFP+free β-HCG+uE3三聯(lián)法篩查，這些篩查方法的靈敏度只有 60%～70%[3-4，6]，為提高DS篩查的靈敏度，臨床上不斷在尋找新的DS篩查標(biāo)志物，有研究表明AFP-L2或AFP-L3篩查DS方面優(yōu)于傳統(tǒng)的AFP篩查[9-10，16-17]，但尚未見有關(guān)AFP-L2和AFP-L3聯(lián)合free β-HCG篩查DS方面的報(bào)道，因此，本研究選擇61例健康胎兒孕婦和88例產(chǎn)前診斷為DS胎兒的孕婦作為研究對(duì)象，以探討母血清AFP-L2和AFP-L3與DS胎兒的相關(guān)性，并比較AFP-L2和AFPL3代替AFP后，聯(lián)合free β-HCG并建立不同建模聯(lián)合DS篩查效能情況。

圖2 AFP-L2、AFP-L3等多項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合篩查DS的ROC曲線

本研究結(jié)果顯示，DS胎兒的孕婦血清AFP-L2、AFP-L3水平均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。俞菁等[10]研究結(jié)果表明DS孕婦血清AFPL2%高于健康孕婦，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。龍峰等[18]研究結(jié)果示DS孕婦血清中AFP-L3%高于正常孕婦，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），上述研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致，但Huai等[19]研究結(jié)果表明孕有DS胎兒孕婦血清AFP-L3中位數(shù)為0.46，顯著低于1在正常對(duì)照組（P＜0.05），與本研究結(jié)果不同，可能與采用AFP-L3評(píng)價(jià)方式不同有關(guān)。

本研究AFP-L2篩查DS胎兒的AUC=0.891（95%CI：0.841～0.941），P＜0.01。AFP-L3 篩查 DS 胎兒 AUC=0.824（95%CI：0.756～0.891），P＜0.01。遠(yuǎn)高于 AFP 的AUC=0.509（95%CI：0.414～0.603）。龍峰等[18]AFP-L3%的AUC=0.710，結(jié)果顯示以AFP-L3%≥10%為界限時(shí)，可以很好地區(qū)分DS孕婦和正常孕婦。Yamamoto等[9]AFP、AFP-L3%、AFP-L3和 AFP-L3/AFP的 AUC=0.750、0.868、0.949和0.946。AFP-L3和AFP-L3/AFP的AUC顯著高于 AFP-L3%（P＜0.05）和 AFP（P＜0.05），與本研究結(jié)果相近。根據(jù)ROC曲線計(jì)算出AFP-L2、AFP-L3篩查DS胎兒的最佳臨界值分別為：6.24ng/ml、1.75ng/ml時(shí)，其靈敏度、特異度、約登指數(shù)分別為：0.721、1.000、0.721；0.663、0.967、0.627。均高于 AFP 的 0.525、0.558、0.083。

Huai等[19]研究結(jié)果表明使用1/270為臨界值時(shí)，如果AFP-L3替代 AFP對(duì)三聯(lián)篩查（AFP、HCG、uE3）檢測的靈敏度從74%提高到81%，假陽性率從5.4%到6.8%略有增加。同樣，如果采用四聯(lián)篩查（AFP、HCG、uE3，抑制素A）檢測，AFP-L3取代AFP后，其靈敏度從81%提高到89%，假陽性率從4.6%到5.6%略有增加。在中孕期DS篩查中AFP-L3替代AFP在稍高的假陽性率為代價(jià)時(shí)，具有更高的靈敏度。Yamamoto等[20]研究結(jié)果表明母體血清中AFP-L3%能有效區(qū)分是否孕有DS患兒。在假陽性率5%時(shí)，孕婦血清AFP-L3%可發(fā)現(xiàn)55%的DS患兒。在產(chǎn)前DS篩查上AFP-L3可以有效替代AFP。本研究也是以AFP-L2、AFP-L3替代AFP并與free β-HCG建立不同模型分析后結(jié)果顯示，以AFPL2+AFP-L3+free β-HCG篩查DS胎兒的AUC最高=0.929（95%CI：0.861～0.975）。最佳臨界值為 1/1 636 時(shí)靈敏度、特異度、約登指數(shù)分別為：0.907、0.857、0.764，不同模型聯(lián)合篩查DS的效能高低順序是以AFP-L2+AFP-L3+free β-HCG＞AFP-L2+free β-HCG＞AFPL3+free β-HCG＞AFP+free β-HCG。

目前AFP-L2、AFP-L3作為科研試劑成本為每人次100元左右，相比傳統(tǒng)AFP試劑成本略高，如果以后能推廣為常規(guī)檢測，則試劑成本應(yīng)該與AFP相近。

綜上所述，中孕期母血清AFP-L2和AFP-L3篩查DS胎兒具有較高的靈敏度和特異度，可替代AFP篩查DS，并以AFP-L2+AFP-L3+free β-HCG聯(lián)合篩查效能最高。