宋少鵬 馬秀嵐

中耳膽脂瘤是角化的鱗狀上皮和上皮下結(jié)締組織以及角蛋白碎片在中耳進行性累積而成，伴或不伴有周圍組織的炎性反應(yīng)[1]。其形成的確切機制尚不清楚，雖然不同的研究已經(jīng)揭示了中耳膽脂瘤組織的骨質(zhì)破壞性和過度增殖行為，但關(guān)于細(xì)胞分化如何影響膽脂瘤生長尚未達成一致意見，有學(xué)者認(rèn)為膽脂瘤上皮存在高分化現(xiàn)象[2, 3]，也有學(xué)者認(rèn)為膽脂瘤上皮的分化受到抑制[4, 5]，因此，有必要對膽脂瘤分化失調(diào)進行深入研究。Rho-Rho激酶(Rho/ Rho-associated coiled coil-containing protein kinase,Rho-Rock)信號通路主要對細(xì)胞分化、增殖、凋亡和細(xì)胞周期進展等方面產(chǎn)生影響[6]。過度增殖、遷移、分化改變等是膽脂瘤的特征，而Rock對這些性質(zhì)具有很大的影響[7]。Chapman等[8]通過基因表達分析證明Rock抑制劑主要抑制角質(zhì)細(xì)胞分化，在除去Rock抑制劑之后，細(xì)胞生長緩慢并且在幾次傳代后開始衰老，恢復(fù)正常分化。本研究擬通過檢測中耳膽脂瘤標(biāo)本中Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶1(Rho-associated coiled coil-containing protein kinase 1, Rock1 )和Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶2(Rock2 )的表達水平，分析它們之間的相關(guān)性，并探究Rock蛋白在膽脂瘤生長過程中的作用。

1 材料與方法

1.1中耳膽脂瘤及正常對照皮膚標(biāo)本收集 取通過中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院耳科2017年3月～2017年12月手術(shù)的中耳膽脂瘤標(biāo)本27例(病例組)，其中男15例，女12例；年齡7～83歲，平均41.30±19.25歲，病程2個月～60年；全部患者術(shù)前的臨床診斷以及術(shù)后病理診斷均為膽脂瘤。同時取其中20例行乳突切開+鼓室成形+耳甲腔成形術(shù)患者中廢棄的外耳道深部皮膚組織為對照組，其中男10例，女10例；年齡13～83歲，平均47.40±15.68歲，病程1年～54年。全部標(biāo)本行固定包埋處理。

1.2標(biāo)本染色步驟 ①切片脫蠟，充分水化后，PBS漂洗3 min，3次；②3%H2O2封閉內(nèi)在過氧化酶，37 ℃溫箱條件下孵化30 min；PBS清洗5 min，3次；③抗原修復(fù)液I修復(fù)30 min，PBS浸泡5 min，3次；④加山羊血清50 μl，37 ℃溫箱條件下封閉內(nèi)在生物素20 min；⑤滴加適當(dāng)濃度的一抗50 μl/片，4 ℃過夜(至少18 h)；⑥PBS沖洗5 min，3次。滴加二抗50 μl/片，37 ℃ 20分鐘；PBS洗5 min，3次；⑦滴加適當(dāng)體積的鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶，37 ℃ 20 min；PBS浸泡5 min，3次；⑧DAB著色，鏡下控制，蒸餾水中斷反應(yīng)；⑨蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水。二甲苯透明，中性樹膠封固。使用PBS溶液取代一抗作為陰性對照，使用已知的陽性片作為陽性對照，排除非特異性著色。

1.3Rock1及Rock2表達水平判定 鏡下觀察Rock1及Rock2蛋白著色情況，以細(xì)胞質(zhì)著棕黃色者為陽性細(xì)胞。評分方法先按著色程度計分：沒有黃色計0分，弱棕黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計為3分；接著使用400×光學(xué)顯微鏡選擇5處沒有互相重疊的視野，每一個都計算100個細(xì)胞，再按著色范圍計分：無染色為0分，<20%為1分，21%～50%為2分；>50%為3分，計算每個視野平均得分。將著色強度得分與著色范圍得分相乘為最后得分，0～2分者為陰性(-)，3分或以上者為陽性(+)[9]。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 使用統(tǒng)計分析軟件SPSS 20.0，Rock1和Rock2蛋白在病例組與對照組間的陽性率比較使用χ2檢驗，Rock1和Rock2蛋白在膽脂瘤中的相關(guān)性分析使用Spearman檢驗；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Rock1在病例組和對照組中的表達 Rock1蛋白在膽脂瘤上皮細(xì)胞的胞質(zhì)呈強陽性表達，顏色為棕黃色，27例病例組標(biāo)本中21例陽性，陽性率77.78%；陰性對照無染色。在正常外耳道皮膚中Rock1蛋白呈弱陽性或陰性表達，20例對照組標(biāo)本中，5例陽性，陽性率25.0%。中耳膽脂瘤組織中Rock1的表達明顯高于外耳道皮膚，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=12.948，P<0.05)(圖1、2)。

2.2Rock2在病例組和對照組中的表達 Rock2在外耳道皮膚細(xì)胞的胞質(zhì)呈強陽性表達，顏色為棕黃色，20例標(biāo)本中有18例陽性，陽性率達90.0%；陰性對照沒有染色。 Rock2在中耳膽脂瘤上皮細(xì)胞呈弱陽性或陰性表達，27例膽脂瘤標(biāo)本中有7例陽性，陽性率25.93%。中耳膽脂瘤組織中Rock2的表達低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=18.945，P<0.05)(圖3、4)。

圖1 Rock1在膽脂瘤組織中的陽性表達 (SP法×400)圖2 Rock1在外耳道皮膚組織中的陰性表達 (SP法×400)圖3 Rock2在膽脂瘤組織中的陰性表達 (SP法×400)圖4 Rock2在外耳道皮膚組織中的陽性表達 (SP法×400)

2.3Rock1和Rock2蛋白在膽脂瘤中表達的相關(guān)性 中耳膽脂瘤中Rock1和Rock2的表達見表1，通過Spearman檢驗，Rock1與Rock2在膽脂瘤組織中的表達呈負(fù)相關(guān)，r=-0.497，P=0.008(P<0.05)；二者在外耳道組織中的表達沒有相關(guān)性。

表1 中耳膽脂瘤組織中Rock1、Rock2蛋白表達(例)

3 討論

中耳膽脂瘤的形成是一個復(fù)雜的多因素相互作用的病理過程[10]，表觀遺傳的改變使上皮過度增殖，炎癥反應(yīng)促進膽脂瘤生長且增加上皮的侵襲性，成骨與破骨細(xì)胞以及凋亡與抗凋亡蛋白失衡等因素共同參與了膽脂瘤的發(fā)生過程。目前關(guān)于膽脂瘤發(fā)病機制的研究主要集中在細(xì)胞過度增殖、凋亡異常和骨質(zhì)破壞三方面，關(guān)于細(xì)胞分化對膽脂瘤作用機制的研究國內(nèi)外報道較少。

RhoA/Rock信號通路在細(xì)胞增殖、分化和凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。Rock屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，是第一個被發(fā)現(xiàn)的RhoA下游效應(yīng)分子，含有Rock1和Rock2兩種異構(gòu)體，它們在其整個氨基酸序列中具有65%的同源性，在其激酶域中具有92%的同源性[12]。Rock 的分子結(jié)構(gòu)包括:①氨基端的激酶催化結(jié)構(gòu)域(激酶區(qū)); ②中間的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，此段包含了Rho 蛋白結(jié)合區(qū); ③竣基端的PH 結(jié)構(gòu)域和半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域[13]。激活的Rock可促進肌動蛋白聚合與活化，從而調(diào)節(jié)肌動蛋白的穩(wěn)定性；也可通過使肌球蛋白磷酸化來改變細(xì)胞骨架，進而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。

Rock通過調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架的多聚化影響細(xì)胞極性和形態(tài)，從而影響細(xì)胞的最終分化[14]。細(xì)胞骨架在細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用，當(dāng)加入細(xì)胞松弛素D后，細(xì)胞骨架解聚，細(xì)胞形態(tài)改變，促進細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化[15]。當(dāng)調(diào)控Rock和其下游靶蛋白，擾亂細(xì)胞骨架后，會促進過氧化酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)的表達，使細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化[6]。Nobusue等[16]研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞中轉(zhuǎn)入RhoA過表達質(zhì)粒后，RhoA/Rock信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可使細(xì)胞骨架重塑，從而調(diào)控脂肪細(xì)胞的成脂分化。有學(xué)者研究表明RhoA/Rock信號通路可能參與肌動蛋白細(xì)胞骨架的組裝，細(xì)胞形態(tài)改變及軟骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達，從而介導(dǎo)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化[17]；當(dāng)用低強度脈沖超聲波(low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS)刺激使細(xì)胞形態(tài)改變時，該信號通路可促使細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[18]。

本研究檢測了Rock1和Rock2蛋白在中耳膽脂瘤中的含量，并與外耳道皮膚組織中進行比較，發(fā)現(xiàn)Rock2蛋白在膽脂瘤中的表達明顯低于正常皮膚，與Yesilova等[19]研究一致；而Rock1在膽脂瘤中的表達明顯高于正常皮膚，且Rock1和Rock2的表達在中耳膽脂瘤中呈負(fù)相關(guān)，在外耳道皮膚中卻不存在這種關(guān)系，推測Rock蛋白在膽脂瘤中的異常表達，可能通過調(diào)節(jié)肌動蛋白使角質(zhì)細(xì)胞骨架改變，引起角質(zhì)細(xì)胞極性和形態(tài)變化，從而影響膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞的分化。雖然Rock的2種亞型Rock1和Rock2共享高度保守的激酶結(jié)構(gòu)域，但它們表現(xiàn)出明顯不同的生物學(xué)功能，有報道稱Rock1敲低可促進角質(zhì)細(xì)胞終末分化，相反，Rock2敲低抑制角質(zhì)細(xì)胞終末分化[20]。膽脂瘤的病理生理學(xué)標(biāo)志主要是細(xì)胞過度增殖和角質(zhì)細(xì)胞分化異常[19]，因此，在膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞中，Rock2的表達降低和Rock1表達增高是可能的。

綜上所述， Rock1在中耳膽脂瘤上皮細(xì)胞中的高表達、Rock2的低表達可能對膽脂瘤角質(zhì)細(xì)胞的分化產(chǎn)生重要影響，本研究為進一步揭示中耳膽脂瘤的發(fā)病機制提供了參考依據(jù)、調(diào)控Rock1和Rock2蛋白的表達，可能為中耳膽脂瘤的預(yù)防和治療提供新的思路。