唐旭霞 石涯 諶晶晶 徐慧芳 韓朝

斑馬魚側線系統(tǒng)是由皮膚衍生的重要感覺器官，具有感覺周圍環(huán)境中水流、水溫、水壓及聽覺等功能[1],其側線神經丘毛細胞在結構和功能上與哺乳動物的內毛細胞非常類似，是研究毛細胞發(fā)育、再生和凋亡的重要模型[2，3]。2005年，Ton等[4]首次采用斑馬魚模型來評估藥物耳毒性，隨后，Chiu等[5]使用斑馬魚模型從1 040種藥物中篩查出21種耳毒性藥物。2011年Hirosed[6]應用斑馬魚模型對美國批準的88種抗腫瘤藥的篩查中發(fā)現(xiàn)13種藥物具有耳毒性。結合斑馬魚身體透明的特點，利用DASPEI熒光染料進行活體聽細胞染色，可為高通量藥物耳毒性及聽細胞保護劑研究提供基礎。雷公藤是我國傳統(tǒng)中醫(yī)學中的一種常用中藥，現(xiàn)代藥理表明其具有抗腫瘤、抗炎以及免疫抑制等藥理活性[7]。雷公藤提取物研制的制劑用于治療類風濕性關節(jié)炎、白血病、腎病綜合征、腫瘤等，取得了較好的療效，并已被廣泛認可[8]；然其性辛、苦寒，有大毒，為中國植物圖譜數(shù)據庫收錄的有毒植物。在雷公藤眾多毒性中，偶有對其耳毒性的報道[9],且僅僅提到聽力減退，也無明確的實驗數(shù)據。

本研究利用斑馬魚分別觀察雷公藤多苷在不同濃度下對其聽細胞的損傷情況，同時觀察地塞米松及谷胱甘肽對雷公藤多苷誘導斑馬魚耳毒性是否具有保護作用，探討雷公藤多苷對斑馬魚的耳毒性及其防護方法，為雷公藤的臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物 斑馬魚胚胎的繁殖以自然成對交配的方式進行。受精后6 hpf(即6小時)和 24 hpf對胚胎進行清理(移除已死亡胚胎)后，在 28 ℃條件下用養(yǎng)魚用水孵育胚胎(養(yǎng)魚用水水質：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導率為 480～510 μs/cm；pH 為6.9～7.2；硬度為53.7～71.6 mg/L CaCO3)，以受精后5天(5 dpf)的斑馬魚為研究對象[由于胚胎可以從自身的卵黃囊中獲取營養(yǎng)物質，故在受精后9天內(9 dpf)無需喂食]。

1.2實驗用藥、儀器與試劑 雷公藤多苷片(浙江得恩德制藥有限公司，10 mg/片，批號1307101B，用1%二甲基亞砜(DMSO)配制成濃度為20 mg/ml的儲備液，-20 ℃保存)，慶大霉素(阿拉丁，批號39970，用超純水配制成25 mg/ml的儲備液，-20 ℃保存)。

熒光立體顯微鏡(Nikon AZ 100, Japan)；6孔板(Nest Biotech)；二甲基亞砜(DMSO，阿拉丁，批號1095515)；DASPEI染料(Sigma，批號109k1336)。

1.3實驗方法

1.3.1確定雷公藤多苷的最大非致死濃度(MNLC) 用五個初始檢測濃度(100、50、25、10、5 μg/ml)的雷公藤多苷飼養(yǎng)AB品系、5 dpf(受精后5天)斑馬魚，每個濃度均飼養(yǎng)15尾斑馬魚，飼養(yǎng)24 h結束后，統(tǒng)計各組的斑馬魚死亡數(shù)量，使用Graphpad prism 6.0統(tǒng)計學軟件繪制最佳的濃度效應曲線，經過曲線擬合，并計算雷公藤多苷的LC1(MNLC)。

1.3.2評價雷公藤多苷的耳毒性 實驗組：依據雷公藤多苷濃度效應曲線和最大非致死濃度的結果，選取4個濃度(MNLC、1/2 MNLC、1/4 MNLC、1/8MNLC)，每個濃度均飼養(yǎng)30尾AB品系、5 dpf斑馬魚，分別命名為MNLC組、1/2MNLC組、1/4MNLC組、1/8MNLC組。

陽性對照組(慶大霉素組)：給予慶大霉素2.5 μg/ml飼養(yǎng)30尾斑馬魚；空白對照組：1% DMSO飼養(yǎng)30尾；

藥物處理24 h后，每組隨機選取10尾斑馬魚，用聽細胞特異性熒光染料DASPEI對斑馬魚進行染色，其中DASPEI染料終濃度為1 mM(DMSO1%)，染色1 h后，清洗三次。在熒光顯微鏡下觀察聽細胞的分布和排列，用圖像處理軟件進行圖像分析，計算聽細胞熒光強度(S)。

1.3.3評價谷胱甘肽對雷公藤多苷誘導耳毒性的保護作用 實驗組分為二組：雷公藤多苷10.5 μg/ml單獨飼養(yǎng)(雷公藤組)，谷胱甘肽450 μM預處理1 h后加入雷公藤多苷10.5 μg/ml(雷公藤+谷胱甘肽組)，各30尾斑馬魚；

陽性對照組分為二組：慶大霉素2.5 μg/ml單獨處理(慶大霉素組)，谷胱甘肽450 μM預處理1 h后加入慶大霉素2.5 μg/ml(慶大霉素+谷胱甘肽組)，各30尾斑馬魚；

空白對照組：1% DMSO飼養(yǎng)，30尾斑馬魚；

以上各組共同處理24 h后，熒光染色及處理方法參照1.3.2。

1.3.4評價地塞米松對雷公藤多苷誘導耳毒性的保護作用 實驗組：將雷公藤多苷10.5 μg/ml單獨處理組按照地塞米松濃度分別為0、50、25、12.5 μM,各組均以相應濃度地塞米松預處理1 h后再加入雷公藤多苷飼養(yǎng)，每組30尾斑馬魚；

陽性對照組給予慶大霉素2.5 μg/ml+谷胱甘肽450 μM(慶大霉素+谷胱甘肽組)飼養(yǎng)，30尾；空白對照組：1% DMSO飼養(yǎng)，30尾；

以上各組共同處理24 h后，熒光染色及處理方法參照1.3.2。

1.4統(tǒng)計學方法 雷公藤多苷對斑馬魚聽細胞的損傷率計算公式如下：

統(tǒng)計學分析采用方差分析和Dunnett’s T-檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.5實驗動物的處死 實驗完成后，按照美國獸醫(yī)協(xié)會(AVMA)對動物麻醉處死的規(guī)范要求，用三卡因甲磺酸對各個發(fā)育階段的斑馬魚進行過度暴露處理，從而將斑馬魚處死。

2 結果

2.1確定雷公藤多苷的MNLC 雷公藤多苷誘發(fā)的斑馬魚死亡率見表1，根據表1中的數(shù)據，用GraphPad6.0擬合濃度致死曲線，經過曲線擬合，求得雷公藤多苷的LC1=MNLC=21 μg/ml。

表1 不同濃度雷公藤多苷誘發(fā)的斑馬魚死亡率(n=15)

2.2定量評價雷公藤多苷的耳毒性 各藥物處理5 dpf AB系斑馬魚24 h后，用DASPEI染料進行活體斑馬魚染色，聽細胞與染料結合后，發(fā)綠色熒光。聽細胞分布在側線神經丘及頭部(圖1)。拍照后，用軟件分析圖2中紅色部分中聽細胞熒光強度，各組再進行統(tǒng)計分析。結果顯示：慶大霉素2.5 μg/ml對聽細胞損傷率達88.5%～89.5%，與空白對照組相比具有顯著性差異(P<0.01)。雷公藤多苷低劑量2.625、5.5 μg/ml對聽細胞損傷率分別為8.9%、10.9%，對聽細胞有損傷趨勢，但與空白對照組相比均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。雷公藤多苷高劑量10.5、21 μg/ml對聽細胞損傷率分別為46.9%、92.4%，與空白對照組相比對差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.01)(圖1、2，表2)。

表2 空白對照組、慶大霉素組及不同濃度雷公藤多苷組相對熒光強度及聽細胞損傷率

注：*與空白對照組比較，P<0.01

2.3谷胱甘肽對雷公藤多苷誘導耳毒性的保護作用 單獨應用慶大霉素2.5 μg/ml(慶大霉素組)對斑馬魚聽細胞損傷率達85.8%，谷胱甘肽干預后(慶大霉素+谷胱甘肽組)聽細胞損傷率下降到55.2%，兩者差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；單獨應用雷公藤多苷10.5 μg/ml對聽細胞損傷率達52.5%，谷胱甘肽干預后，斑馬魚聽細胞損傷率達81.8%，兩者差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖3、表3)。

表3 各組應用或不用谷胱甘肽后DASPEI染色相對熒光強度及聽細胞損傷率

注：*與空白對照組組比較，P<0.01；#與慶大霉素組比較，P<0.01；&與雷公藤組比較，P<0.01

2.4地塞米松對雷公藤多苷誘導耳毒性的保護作用 雷公藤多苷10.5 μg/ml對聽細胞損傷率達52.5%(地塞米松用量為0 μM)，12.5、25.0、50.0 μM地塞米松干預后，各組(12.5、25.0、50.0 μM組)聽細胞損傷率分別為64.2%、67.7%、60.8%，四組數(shù)據兩兩比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.01)(圖4、表4)。

表4 空白對照組、慶大霉素+谷胱甘肽組及不同濃度地塞米松處理后雷公藤多苷各組相對熒光強度和聽細胞損傷率

注：*與空白對照組比較，P<0.01

3 討論

3.1雷公藤多苷的耳毒性 雷公藤最早出現(xiàn)在清代趙學敏的著作《本草綱目拾遺》中，1969年去皮雷

圖1 正常斑馬魚DASPEI染色后聽細胞熒光強度圖片(紅色部分中綠色熒光為聽細胞)

圖2 雷公藤多苷對斑馬魚聽細胞熒光強度的影響

圖3 應用谷胱甘肽及雷公藤多苷后斑馬魚聽細胞熒光強度

圖4 應用地塞米松及雷公藤多苷后斑馬魚聽細胞熒光強度

公藤根芯木質部分的煎劑首次被用于臨床治療類風濕性關節(jié)炎，揭開了雷公藤研究與臨床應用的新篇章[10]。雷公藤多苷是由雷公藤去皮根木質部分的氯仿—乙醇提取物，一直以來，雷公藤制劑的藥效和毒性都是眾多專家學者爭議的問題，雷公藤多苷在治療糖尿病腎病[11]、類風濕性關節(jié)炎[12]、原發(fā)性腎病綜合征[13]等疾病方面都具有良好的效果；與此同時，也有確鑿的證據證明其具有肝毒性[14]、生殖系統(tǒng)毒性[15]、消化系統(tǒng)毒性[16]、腎毒性[17]等。所以雷公藤制劑的使用仍有不小的爭議。本研究中對雷公藤多苷的濃度摸索實驗結果明確了雷公藤多苷具有耳毒性，且雷公藤多苷對聽細胞的損傷趨勢存在劑量依賴關系，即隨著劑量的增加，斑馬魚聽細胞數(shù)量減少。

3.2谷胱甘肽對雷公藤多苷耳毒性的影響 還原型谷胱甘肽是谷氨酸、甘氨酸及半胱氨酸組成的三肽，是廣泛存在于正常細胞的一種生理性物質[18]，以往的研究結果[19]明確慶大霉素等氨基糖苷類藥物對耳、腎損傷的機制可能是通過JNK信號通路的過程。谷胱甘肽是體內的重要氧自由基清除劑，對氨基糖苷類藥物引起的耳聾能起到一定的緩解作用。雷公藤多苷在臨床中具有抗炎及免疫抑制雙重作用，有研究表明，使組織內氧自由基的水平的升高[20，21]是雷公藤多苷毒性的重要原因；也有文獻認為雷公藤多苷通過提高大鼠血清中抗氧化酶(SOD和GSH-px)的活性，降低脂質過氧化終極產物(MDA)活性，清除氧自由基[22]，從而對結腸黏膜起到保護作用。 由以上的不同觀點可以看出，與慶大霉素不同的是，雷公藤多苷在不同的環(huán)境中會引起不同的組織反應。因此推測可能是由于雷公藤多苷中的某些成分與谷胱甘肽這類含有巰基的蛋白質結合，致使谷胱甘肽含量降低，氧自由基生成過多，抗氧化系統(tǒng)被損壞，從而出現(xiàn)了氧化應激反應，故從文中結果看，在加入谷胱甘肽后雷公藤多苷對斑馬魚的耳毒性不降反升。

3.3地塞米松對雷公藤多苷耳毒性的影響 地塞米松屬于糖皮質激素，是耳科治療中耳炎及突發(fā)性耳聾的常用藥。地塞米松與細胞凋亡之間的關系較為復雜，有研究表明地塞米松可在體內、體外誘導胸腺細胞凋亡[23]。有學者在豚鼠耳蝸的研究中發(fā)現(xiàn)，地塞米松可以通過抑制誘導性一氧化氮合成酶使凋亡細胞明顯減少[24]。本實驗研究結果顯示，地塞米松對雷公藤多苷耳毒性并無明顯抑制作用，可能的原因有：①與耳毒性產生機制有關：順鉑等耳毒性藥物的研究中明確了地塞米松可以清除這類耳毒性藥物產生的活性氧而達到保護毛細胞的作用，而雷公藤多苷產生耳毒性的機制可能是藥物在內耳積蓄、鈣離子紊亂、代謝障礙等，故地塞米松無法在其耳毒性中發(fā)揮作用；②地塞米松給藥方式：由于糖皮質激素靶向定位差的特點[25]，以往對地塞米松的給藥方式使用的注射方式較多，包括在人體內也常使用鼓室注射，而本次試驗僅僅使用了含有地塞米松的溶液，只有一部分藥物到達內耳，可能需要使用顯微注射的方式精確的內耳給藥才更為有效；③地塞米松的劑量：本實驗使用的地塞米松濃度分級較少，無法準確找出有效劑量，將在后續(xù)的研究中深入探索。

總之，本實驗結果表明，雷公藤多苷具有耳毒性，且存在劑量依賴關系；地塞米松及谷胱甘肽兩類常用藥物對雷公藤多苷所致耳毒性無明顯保護作用。雷公藤多苷是臨床常見藥，但對其耳毒性的研究在國內并不普遍，故本次研究對今后該藥物的使用具有一定的指導意義。本實驗不足之處在于僅僅使用熒光染色作為耳毒性是否發(fā)生的判斷依據，不能從微觀層面反映其耳毒性的發(fā)生機制，未來可以加入聽力水平和分子生物學的研究數(shù)據全面深入探討雷公藤多苷耳毒性的發(fā)生機制及其防治方法。