中藥譜效學研究過程中差異樣品的構(gòu)建及應(yīng)用?

劉宏，蘇薇薇，彭維，姚宏亮

(中山大學生命科學學院∥廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評價工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州510275)

中藥譜效學研究是近年來中藥研究的一個熱點。譜效學能夠準確反映中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，它為中藥質(zhì)量控制、組方科學解析等提供了依據(jù)[1-6]。我們在進行中藥譜效學研究過程中，需尋找中藥化學成分差異與藥效差異的對應(yīng)關(guān)系，因此構(gòu)建原料藥材配比不同的系列差異樣品很有必要；這在國內(nèi)尚處于發(fā)軔階段。我們提出一種中藥譜效學研究過程中差異樣品的構(gòu)建方法，現(xiàn)報道如下。

1 差異樣品構(gòu)建的基本思路與方法

差異樣品構(gòu)建的基本思路：當中藥有效成分群發(fā)生變化時，其藥效也會隨之發(fā)生改變。當某一成分的含量發(fā)生顯著變化，而對應(yīng)的生物活性并無顯著改變，則表明該成分與藥效關(guān)聯(lián)性弱；反之，則表明該成分與藥效關(guān)聯(lián)性強。因此，在構(gòu)建的差異樣品中，各化學成分的變化十分重要?；瘜W成分來源于藥材，而復(fù)方中藥又是由多味藥材組成，通過對各味藥材進行調(diào)整能夠達到構(gòu)建差異樣品的目的。實際應(yīng)用中，復(fù)方中藥涉及到不同的藥材以及各味藥材的多個投料水平，是典型的多因素、多水平試驗設(shè)計，均勻設(shè)計方法的使用則可大大降低試驗次數(shù)并反映差異樣品間的差異性。

基于上述思路，我們提出一種中藥譜效學研究過程中差異樣品的構(gòu)建方法，具體如下：① 將各味組成藥材單獨視作試驗因素；② 根據(jù)原組方比例確定各味藥材的投料量變化范圍；③ 在該范圍內(nèi)確定合適的水平數(shù)；④ 采用均勻設(shè)計方法，根據(jù)因素數(shù)、水平數(shù)選擇合適的均勻設(shè)計表進行藥材及其投料量的均勻排布；⑤ 按照標準工藝流程制備多組差異樣品并進行其指紋圖譜監(jiān)測，采用聚類分析方法驗證差異樣品間的差異性。

2 差異樣品構(gòu)建的具體實施

我們以復(fù)方血栓通膠囊為例說明具體實施過程。復(fù)方血栓通膠囊由三七、丹參、黃芪、玄參組成，方中重用三七之活血化瘀為君藥，丹參為臣藥，破瘀血、補新生血，黃芪之補氣升陽與玄參之滋陰涼血合用治療氣陰兩虛為佐藥。長期大量的醫(yī)療實踐和臨床應(yīng)用證實，復(fù)方血栓通膠囊對眼底及心腦血管疾病療效顯著。復(fù)方血栓通膠囊差異樣品的構(gòu)建步驟如下：

2.1 材料

(1) 儀器、試劑：數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司，KQ-250DE)，渦旋振蕩器(Scientific Industries Vortex-Genie 2)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠，RE-5205/RE-2000B)，烘箱(Millipore，UFB400)，超純水器(Millipore Simplicity)，電子分析天平(Sartorius)，冰箱(Siemens)，燒杯、錐形瓶、蒸餾瓶等玻璃儀器；甲醇、乙腈、磷酸(色譜純)，超純水。

(2) 藥材：三七，批號：161110；丹參，批號：161110；黃芪，批號：161110；玄參，批號：161110，由廣東眾生藥業(yè)股份有限公司提供。

2.2 方法

(1) 三七、丹參、黃芪、玄參投料設(shè)計

復(fù)方血栓通膠囊的原組方比例中三七、丹參、黃芪、玄參所占比例分別為54%、10%、18%、18%。在均勻設(shè)計時，丹參在0%-20%間均勻變化，黃芪在0%-36%間均勻變化，玄參在0%-36%間均勻變化，君藥三七在33.2%-74.8%間均勻變化。根據(jù)四因素十一水平均勻設(shè)計表進行投料，見表1。

(2) 差異樣品的制備

根據(jù)《中華人民共和國藥典》2015年版復(fù)方血栓通膠囊標準工藝流程[7]，按表1進行藥材投料：三七粉碎后用φ=50%乙醇浸漬提取2次，浸漬液濾過，濾液合并，回收乙醇并濃縮成浸膏；丹參、黃芪、玄參三味藥材，用φ=50%乙醇加熱回流提取2次，提取液濾過，濾液合并，回收乙醇并濃縮成浸膏；將上述兩份浸膏混合，即得。

表1 復(fù)方血栓通膠囊差異樣品的藥材投料量及其比例Table 1 Herb proportions in Compound Xueshuantong Capsule (CXC) samples

(3) 差異樣品的指紋圖譜監(jiān)測[8-9]

儀器與試劑：Dionex Ultimate 3000 DGLC高效液相色譜儀，Dionex Acclaim?120 C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，3 μm)，乙腈、磷酸(色譜純)，超純水。

供試品制備：取11組差異樣品各約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加φ=70%甲醇20 mL，密塞，超聲處理60 min，濾過，取濾液，減壓回收溶劑至近干， 加φ=50%甲醇使溶解，定量轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶，加φ=50%甲醇至刻度，搖勻，用0.22 μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

液相色譜條件：流動相A乙腈(0-50 min，15%→34%)，流動相Bw=0.05%磷酸溶液(50-59 min，34%→75%)，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長203 nm、270 nm。

2.3 結(jié)果

指紋圖譜及其聚類分析結(jié)果：11組差異樣品的色譜圖見圖1。根據(jù)20個共有峰峰面積，將其導(dǎo)入SPSS 21.0中對差異樣品S1-S11進行聚類，聚類方法為Between-groups linkage，距離計算方法采用Minkowski。如圖2所示，當Rescaled Distance Cluster Combine為4時，差異樣品可分為8類，存在明顯的化學成分含量差異。

圖1 復(fù)方血栓通膠囊差異樣品HPLC色譜圖(A:203 nm；B:270 nm)Fig.1 HPLC chromatogram of CXC samples (A: 203 nm; B: 270 nm)

圖2 復(fù)方血栓通膠囊差異樣品聚類分析結(jié)果Fig.2 Cluster analysis of CXC samples

3 討 論

由兩味藥材組成的復(fù)方中藥品種，藥材及成分組成相對簡單，可直接通過對藥材進行均勻配比的方法制備差異樣品。當組方藥材增加到三味及以上時，通過簡單的藥材均勻加減進行調(diào)配不再適用，一方面是由于很難滿足各味藥材的投料比的總和為100%，另一方面所構(gòu)建的差異樣品在全部藥材組合下的空間分布不均勻，無法體現(xiàn)出差異性。在這種情況下，可考慮應(yīng)用均勻設(shè)計思想指導(dǎo)各味藥材的投料比例。

在差異樣品的均勻設(shè)計中，因素數(shù)、水平數(shù)、投料變化范圍的確定十分重要。當組方由三至六味藥材組成時，因素數(shù)可直接由各味藥材確定；水平數(shù)的確定，一方面考慮到為后續(xù)的差異樣品化學信息與藥效信息相關(guān)提供充足的樣品保證，另一方面需考慮試驗次數(shù)的增加帶來的工作難度，一般考慮9-11水平，即構(gòu)建9-11組差異樣品為宜。

投料變化范圍的確定，要考慮中藥組方中的“君臣佐使”方解，在實際應(yīng)用中，“君”藥在整個組方中具有十分重要的地位，其投料范圍在一定范圍內(nèi)調(diào)整但不能缺失，而“臣”、“佐”、“使”藥可根據(jù)需要設(shè)置缺失；上述三個參數(shù)的設(shè)定原則在應(yīng)用實例復(fù)方血栓通膠囊的差異樣品構(gòu)建中均有體現(xiàn)。

當組方由六味及以上的藥材組成時，若因素數(shù)直接由藥材數(shù)量確定，均勻設(shè)計試驗的水平數(shù)至少要在12水平以上，保證較好的均勻度則需更進一步增加水平數(shù)，大大增加了工作量與難度。因此，建議根據(jù)藥材的化學性質(zhì)或傳統(tǒng)方解中的君臣佐使，先把所有藥材分為三至六類，再進一步構(gòu)建所需差異樣品。

應(yīng)用實例中，我們介紹了復(fù)方血栓通膠囊具有化學成分差異的樣品構(gòu)建過程，這些差異樣品在藥效上是具有明顯差異的[2]。

近年來，我們還完成了腦栓通膠囊[10]、參芪扶正注射液[11]、丹紅注射液[12]、口炎清顆粒[13]等中藥品種差異樣品的構(gòu)建及其藥效、機理、譜效關(guān)聯(lián)研究。上述實踐與應(yīng)用經(jīng)驗表明：本文提出的方法不同于以往的化學成分逐一分離、再組合的方式，而是在尊重原組方藥材比例的基礎(chǔ)上從整體對復(fù)方中藥的藥材進行重新調(diào)整、組合，具有實現(xiàn)難度小、適用性高的優(yōu)點，符合中藥的混合性、整體性、統(tǒng)一性特點。