HPLC 法同時(shí)測(cè)定腫節(jié)風(fēng)三清顆粒中2 種成分

陶 卿， 劉 磊， 唐廷崇， 吳文健， 何家康

（1. 廣西北斗星動(dòng)物保健品有限公司， 廣西 南寧530001； 2. 廣西大學(xué)， 廣西 南寧530004）

腫節(jié)風(fēng)為金粟蘭科植物草珊瑚Sarcandra glabra（Thunb.） Nakai 的干燥全草， 主產(chǎn)于四川、 福建、 廣西等地， 其味苦、 微辛， 性平， 歸心、 肝經(jīng)， 具有清熱涼血、活血化瘀、 祛風(fēng)通脈等功效， 用于血熱發(fā)斑發(fā)疹、 風(fēng)濕痹痛、 跌打損傷［1-2］。 腫節(jié)風(fēng)三清顆粒是將腫節(jié)風(fēng)、 射干、 甘草按中獸醫(yī)理論組方制成的顆粒， 具有祛痰、 平喘、 止咳等功效， 臨床用于雞慢性支氣管炎等呼吸道疾病。 現(xiàn)行獸藥典［3］中收載了腫節(jié)風(fēng)， 但僅檢測(cè)異嗪皮啶含有量， 而現(xiàn)有研究表明迷迭香酸具有抗菌、 抗血栓、 抗血小板聚集等生物活性， 與腫節(jié)風(fēng)藥理作用和臨床適應(yīng)癥相吻合［4-6］， 故為了提高產(chǎn)品質(zhì)量， 準(zhǔn)確檢測(cè)出產(chǎn)品中異嗪皮啶、 迷迭香酸含有量顯得尤為重要。 參考文獻(xiàn)［7-9］， 本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定腫節(jié)風(fēng)三清顆粒中異嗪皮啶、 迷迭香酸的含有量， 以期為該制劑質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器 LC-20AT 高效液相色譜儀， 配置SPD-20A 紫外檢測(cè)器、 SIL-20A 自動(dòng)進(jìn)樣器， 購(gòu)于日本島津制作所；BP211D 電子分析天平， 購(gòu)于德國(guó)賽多利斯公司； TU-1901紫外可見分光光度計(jì)， 購(gòu)于北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 試藥 腫節(jié)風(fēng)三清顆粒（批號(hào)20121001）， 由廣西北斗星動(dòng)物保健品有限公司提供。 異嗪皮啶、 迷迭香酸對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院（批號(hào)110837-201206、11871-201102）。 腫節(jié)風(fēng)、 射干、 甘草均購(gòu)于南寧生源中藥飲 片 有 限 責(zé) 任 公 司 （ 批 號(hào) 20110501、 20110901、20110801）， 經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室銀勝高副教授鑒定為正品。 乙腈、 甲醇、 磷酸均為色譜純； 水為超純水。

2 方法

2.1 色譜條件 Phenomenex Luna C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）， 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑； 流動(dòng)相乙腈（A） -0.1% 磷酸（B）， 梯度洗脫（0 ～5 min，10%A； 5～25 min， 10% ～18% A； 25 ～52 min， 18% ～25%A； 52～60 min， 25% ～100%A）； 體積流量1.0 mL／min； 檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm； 進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取對(duì)照品異嗪皮啶1.0 mg、迷迭香酸1.5 mg， 置于25 mL 量瓶中， 甲醇稀釋至刻度，搖勻， 即得（線性關(guān)系考察用）。 再精密稱取2 種對(duì)照品適量， 置于25 mL 量瓶中， 甲醇稀釋至刻度， 即得（兩者各含10 μg／mL， 加樣回收率試驗(yàn)用）。

2.3 供試品溶液制備 精密稱取顆粒粉末1.0 g， 置于100 mL具塞錐形瓶中， 加入50 mL 甲醇， 水浴加熱回流1 h，放冷， 搖勻， 0.45 μm 微孔濾膜濾過， 取續(xù)濾液， 即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 按處方比例制備缺腫節(jié)風(fēng)的陰性樣品， 按“2.3” 項(xiàng)下方法制備， 即得。

3 結(jié)果

3.1 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品、 供試品、 陰性樣品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 結(jié)果見圖1。 由圖可知，異嗪皮啶、 迷迭香酸均與相鄰峰的分離度良好（＞1.5），陰性無干擾。

3.2 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品溶液1、 2、 3、 4、5 mL， 置于10 mL 量瓶中， 甲醇稀釋至刻度， 精密量取10 μL， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。 以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）， 峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸， 得異嗪皮啶、 迷迭香酸回歸方程分別為Y ＝28 658.43X ＋8 264.565（r ＝0.999 7）、 Y ＝27 783.65X-11 532.53 （r ＝0.999 7）， 分別在3.795 ～18.975、 6.035 ～30.175 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL， 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次， 測(cè)得異嗪皮啶、 迷迭香酸峰面積RSD 分別為1.17%、 0.72%， 表明儀器精密度良好。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取顆粒（批號(hào)20101201） 6 份，按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得異嗪皮啶、 迷迭香酸含有量RSD 分別為1.2%、 1.15%， 表明該方法重復(fù)性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取顆粒（批號(hào)20101201） 1.0 g，按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 于室溫下放置0、 2、4、 8、 12、 16、 24 h 后在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得異嗪皮啶、 迷迭香酸含有量RSD 分別為0.72%、0.71%， 表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取含有量已知的顆粒（批號(hào)20101201） 0.5 g， 平行6 份， 精密加入“2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液25 mL， 按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 結(jié)果見表1。

3.7 樣品含有量測(cè)定 取3 批顆粒， 按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL 測(cè)定， 計(jì)算含有量， 結(jié)果見表2。

4 討論

查閱2015 年版《中國(guó)藥典》 一部發(fā)現(xiàn)， 腫節(jié)風(fēng)含有量測(cè)定項(xiàng)下的檢測(cè)波長(zhǎng)為342 nm， 為異嗪皮啶最大吸收， 而迷迭香酸最大吸收波長(zhǎng)為330 nm。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 在330 nm波長(zhǎng)下2 種成分均有靈敏度高的較強(qiáng)吸收， 故選擇其作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

表1 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

表2 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（n＝3）

腫節(jié)風(fēng)三清顆粒是由腫節(jié)風(fēng)、 射干、 甘草3 味藥材經(jīng)提取后加工制成， 成分較復(fù)雜。 前期曾按文獻(xiàn)［10-11］ 方法檢測(cè)異嗪皮啶、 迷迭香酸， 但雜質(zhì)峰不能得到有效分離，本實(shí)驗(yàn)通過查閱大量文獻(xiàn)結(jié)合《中國(guó)藥典》， 對(duì)色譜條件進(jìn)行反復(fù)探索優(yōu)化， 最終確定“2.1” 項(xiàng)下條件。 同時(shí)，還驗(yàn)證該條件在不同品牌色譜柱、 柱溫下的分離效果， 發(fā)現(xiàn)室溫下各色譜柱均能將主峰與雜質(zhì)峰有效分離， 而且峰形良好， 保留時(shí)間適中， 適用于該制劑含有量測(cè)定。

目前， 在人醫(yī)臨床上以腫節(jié)風(fēng)的為主的藥物制劑已得到廣泛應(yīng)用［12］， 有片劑、 口服液、 注射液等劑型， 其質(zhì)量控制方法也較成熟， 而且研究人員對(duì)該藥材大部分有效成分進(jìn)行提取分離， 還深入考察有效部位在體內(nèi)的作用機(jī)制和代謝過程， 為臨床用藥提供依據(jù)。 然而， 在獸醫(yī)臨床上腫節(jié)風(fēng)浸膏及制劑的標(biāo)準(zhǔn)均未收載于獸藥典， 表明其開發(fā)相對(duì)滯后。 本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定腫節(jié)風(fēng)三清顆粒中異嗪皮啶、 迷迭香酸的含有量， 以期能促進(jìn)相關(guān)獸藥制劑標(biāo)準(zhǔn)的制訂， 并充分發(fā)揮腫節(jié)風(fēng)在獸醫(yī)臨床上的疫病防治作用。