單 藝，王象欣，陳美君，姜毓君,3，滿朝新,3，馬 微

（1.東北農業(yè)大學黑龍江省綠色食品科學研究院，黑龍江 哈爾濱 150028；2.東北農業(yè)大學食品學院，乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；3.食品安全和營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心，黑龍江 哈爾濱 150028；4.東寧出入境檢驗檢疫局，黑龍江 東寧 157200）

三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪、雙氰胺和縮二脲這4 種含氮量較高且性質穩(wěn)定、價格低廉的化合物被稱作偽蛋白。添加到乳制品中使得蛋白質的含量遠高于其實際含量，從而提高乳制品的附加值。同時，這類偽蛋白可作為動植物飼料，被廣泛的應用于反芻動物飼養(yǎng)以及草場肥料等方面，也大大增加了其進入乳制品中的風險，嚴重危害人類健康[1-3]，阻礙企業(yè)乃至行業(yè)的生存發(fā)展[4]。目前食品安全國家標準規(guī)定的蛋白質測定方法為凱氏定氮法，該法通過測定氮元素的含量間接對食品中蛋白質進行定量，而不是測定蛋白質的真實值。

根據(jù)衛(wèi)生部等5個部門關于三聚氰胺在食品中的限量值的公告（2011年第10號），我國對嬰幼兒配方粉中三聚氰胺的最高殘留限量為1 mg/kg。美國和歐盟各國規(guī)定了環(huán)丙氨嗪在畜產(chǎn)品中的最高殘留限量為0.05 mg/kg[5]。尚未對食品中的雙氰胺和縮二脲進行限量，但高劑量攝入可能對人體健康產(chǎn)生危害[6-7]。目前測定三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪、雙氰胺和縮二脲的方法主要有離子色譜法[8]、氣相色譜-質譜法[9]、液相色譜法[10-13]、液相色譜-串聯(lián)質譜[14-18]等。對于乳制品這種復雜基質樣品的分析，對目標化合物的提取主要有固相萃取法[19]、液液萃取法[20-21]等，由于以上4 種化合物性質不盡相同，固相萃取法同時凈化比較困難，液液萃取法凈化效果一般，基質效應改善不明顯，操作較復雜。分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）是對印記分子及其結構類似的客體分子具有特異選擇性和識別能力的高分子功能材料，具有抗干擾性強、選擇性高、穩(wěn)定性好、使用壽命長等特點，適用于復雜樣品的前處理[22]。近年來，磁性納米粒子由于具有較大的表面積和獨特的物理化學性質，將其與MIPs相結合制備成磁性分子印跡聚合物（magnetic molecularly imprinted polymers，MMIPs），MMIPs在完成對目標化合物的特異性識別、吸附后，只需在外加磁場的條件下即可實現(xiàn)與溶液的分離。其操作簡單且分離時間短，使得分子印跡技術的應用領域得到進一步的發(fā)展。MMIPs作為一種新型的功能性材料，被廣泛應用到細胞學、生物工程、生物醫(yī)藥和食品或環(huán)境中有害物質富集檢測等領域[23-29]。

本實驗利用磁性分子印跡技術，以縮二脲-13C2和環(huán)丙氨嗪-D4為模板分子，F(xiàn)e3O4為磁性納米顆粒，制備對三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪、雙氰胺和縮二脲具有特異性識別的MMIPs。MMIPs結合同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法，實現(xiàn)乳及乳制品中偽蛋白的特異性分離、富集和定性及定量分析。該方法快速、靈敏、準確度高，為磁性分子印跡技術在乳制品檢測中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

液態(tài)奶、酸奶、乳飲料等30 種乳制品 市購。

氯化鐵、硫酸鐵、氨水、油酸、甲基丙烯酸（methacrylic acid，MAA）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（ethylene glycol dimethacrylate，EGDMA）、偶氮二異丁腈（azodiisobutyronitrile，AIBN）（均為優(yōu)級醇），雙氰胺標準品、縮二脲標準品、縮二脲-13C2內標（C）、三聚氰胺-三胺-15N3內標（）（純度均為99.0%） 美國Sigma-Aldrich公司；聚乙二醇6000（polyethylene glycol，PEG-6000）（分析純） 西隴化工有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP） 國藥集團化學試劑有限公司；三聚氰胺標準品（純度99.0%）、環(huán)丙氨嗪標準品（純度99.0%） 美國Fluka公司；環(huán)丙氨嗪-D4（C6H6N6D4，純度99.0%） 德國Dr. Ehrenstorfer公司。實驗用水為電阻率18.2 MΩ·cm去離子水，由Milli-Q超純水儀提供。

1.2 儀器與設備

ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀、Xevo TQ三重四極桿串聯(lián)質譜儀、Mass LynxTM色譜工作站 美國Waters公司；QGC-12T干熱式氮吹儀 上海泉島科貿有限公司；BS210S型電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司；MARS 6微波消解儀、聚四氟乙烯XP55T高壓反應罐 美國CEM公司。

1.3 方法

1.3.1 表面修飾Fe3O4磁流體納米顆粒的制備

利用共同沉淀法制備Fe3O4顆粒[30]。將含有FeCl3（2.0 mol/L）和FeSO4（1.0 mol/L）的混合溶液加熱至50 ℃，加入氨水直到溶液pH 9，此時可見溶液中的Fe3O4深褐色沉淀。靜置一段時間，移去上層清液。取出每份約8 mL的Fe3O4放入微波消解罐中，沖入氮氣，擰緊旋蓋放入微波消解儀，800 W、70 ℃熟化30 min。冷卻到室溫后，將最終的黑色沉淀進行減壓抽濾，用去離子水及10%乙酸反復洗滌，去除表面的雜質。取大約2 g制備的Fe3O4顆粒，加入約40 mL去氧水，在氮氣保護、80 ℃條件下加入油酸2 mL，反應30 min使Fe3O4充分被油酸包裹，降溫至約50 ℃，加入PEG-6000 10.0 g，超聲15 min，稀釋至100 mL，冷卻后即得到穩(wěn)定的表面修飾Fe3O4磁流體納米顆粒。

1.3.2 MMIPs的制備

1.0 mmol縮二脲-13C2溶于20 mL甲醇-水（1∶1，V/V）溶液中，再加入6 mmol MAA攪拌30 min，得到縮二脲-13C2與功能單體的復合物溶液；再加入20 mmol EGDMA和1.3.1節(jié)制備的1 g Fe3O4磁流體納米顆粒，超聲30 min得到預聚合復合物溶液。0.4 g PVP溶于100 mL乙醇中，溶解后充入氮氣，同時加熱至60 ℃。加入上述聚合復合物溶液和0.1 g AIBN，在60 ℃、氮氣保護下反應24 h。冷卻后在外部磁場作用下將聚合物與溶液分離，分別用去離子水、甲醇-乙酸（8∶2，V/V）溶液沖洗，直到洗脫液用液相色譜-質譜檢測不到縮二脲-13C2（印跡分子）。然后將此聚合物用水沖洗，在60 ℃條件下干燥，制得可同時吸附雙氰胺、縮二脲的MMIPs微球1-MMIPs[31-33]。

1.0 mmol環(huán)丙氨嗪-D4溶于20 mL甲醇-水（1∶1，V/V）溶液中，再加入8 mmol MAA，攪拌30 min，得到環(huán)丙氨嗪-D4與功能單體的復合物溶液；再按照上述步驟完成聚合反應，制得可同時吸附三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪的MMIPs微球2-MMIPs[33]。

1.3.3 色譜條件

A C Q U I T Y U P L C B E H A m i d e色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相A為含1%甲酸的5 mmol/L甲酸銨，流動相B為乙腈；梯度洗脫：0～2 min，3% A；2～3.2 min，3%～20% A；3.2～4.2 min，20%～30% A；4.2～4.5 min，30%～3% A；4.5～7 min，3% A。流速0.4 mL/min；柱溫30 ℃；樣品室溫度20 ℃；進樣量10 μL。

1.3.4 質譜條件

電噴霧離子源；正離子掃描；毛細管電壓0.5 kV；離子源溫度120 ℃；去溶劑氣溫度400 ℃；去溶劑氣流速900 L/h；錐孔氣流速50 L/h；碰撞氣體為氬氣，碰撞氣流速0.24 mL/min；掃描方式為多反應監(jiān)測模式；質譜分析參數(shù)見表1。

表1 質譜多反應監(jiān)測實驗條件Table1 Mass spectrometric conditions of multiple reaction monitoring (MRM)

1.3.5 混合標準溶液的配制

分別將雙氰胺標準品、縮二脲標準品、三聚氰胺標準品、環(huán)丙氨嗪標準品、三聚氰胺-三胺-15N3內標物用乙腈-水（50∶50，V/V）溶液配制成1 000 μg/L的標準儲備液，－18 ℃避光冷藏保存。臨用時，用乙腈-水（50∶50，V/V）溶液逐級稀釋雙氰胺、縮二脲、三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪標準儲備溶液，配制成所需的混合標準溶液中間液，混合標準工作液以空白樣品提取液稀釋配制，混合標準工作液定容前需加入適量三聚氰胺-三胺-15N3內標物，使三聚氰胺-三胺-15N3內標物質量濃度為1 μg/mL。

1.3.6 樣品制備過程

液態(tài)奶、酸奶、乳飲料等樣品，準確稱取12.5 g于三角瓶中；奶粉樣品，準確稱取2.0 g于三角瓶中，加入12.5 mL水溶解，加入12.5 mL乙腈，超聲提取30 min。加入50 μL 1 000 μg/mL的三聚氰胺-三胺-15N3內標溶液，用乙腈-水（50∶50，V/V）溶液定容至50 mL，搖勻，濾紙過濾。稱取150 mg MMIPs于燒杯中，按順序加入4 mL甲醇，4 mL去離子水，攪拌活化。在外部磁場作用下使MMIPs與液體分離，并棄去液體。加入15 mL去離子水，3 mL樣品濾液，此混合液體攪拌6 min，使目標化合物被MMIPs吸附。在外磁場作用下使MMIPs與溶液分離，棄去上層液體后，用3 mL 20%甲醇溶液清洗MMIPs表面。用甲醇-乙酸（95∶5，V/V）溶液洗脫被MMIPs吸附的目標化合物。加入1 mL甲醇-乙酸（95∶5，V/V）溶液，超聲1 min，在外磁場作用下使MMIPs與溶液分離，收集液體，此操作重復6 次。6 次的洗脫液合并后約6 mL，在50 ℃氮氣吹干后，加入1.0 mL流動相A溶解殘渣，過0.22 μm濾膜后上機測定。

2 結果與分析

2.1 MMIPs的合成與分子識別

圖1 表面修飾Fe3O4磁流體納米顆粒在外部磁場作用下的磁分離Fig.1 Magnetic separation of surface modified Fe3O4 nanoparticles

本實驗利用共沉淀法制備磁性Fe3O4納米微球，與傳統(tǒng)方法相比，采用微波進行熟化處理使得Fe3O4結晶程度提高；加入油酸和PEG-6000對其進行包裹，PEG-6000的疏水端和油酸的疏水端形成雙層膠束，使磁性粒子能很好地分散在溶液中。添加PVP使Fe3O4納米顆粒在水中洗滌幾次或強力攪拌后仍能長時間穩(wěn)定分散，并且放置4 個月以上沒有沉淀產(chǎn)生[34]。如圖1所示，在外磁場作用下偽蛋白磁性印跡聚合物迅速吸附沉降，具有很好的磁敏感性。由于三聚氰胺與環(huán)丙氨嗪有相似的化學結構，縮二脲與雙氰胺也有類似化學結構，本實驗選擇環(huán)丙氨嗪和縮二脲的2 種同位素，即環(huán)丙氨嗪-D4和縮二脲-13C2作為模擬印跡分子合成MMIPs，可以對4 種化合物進行特異性吸附，避免了4 種化合物之間的測定干擾[35]。

制備MMIPs時，功能單體的選擇、功能單體與印跡分子的配比都至關重要。堿性印跡分子常選用酸性功能單體，因此本實驗在制備MMIPs時，選用酸性功能單體MAA。印跡分子與功能單體MAA混合，它們之間通過氫鍵作用形成功能單體-印跡分子復合物。將形成的單體-印跡分子復合物、交聯(lián)劑EGDMA和表面修飾Fe3O4磁流體納米顆?；旌?，在引發(fā)劑AIBN的作用下采用熱引發(fā)方式將單體-印跡分子復合物、交聯(lián)劑EGDMA和Fe3O4磁流體納米顆粒聚合，形成高聚物。最后，將三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪、雙氰胺和縮二脲印跡分子從高聚物中洗脫出來，這樣高聚物上就留出與印跡分子形狀、大小完全相同且具有特異識別性的孔穴。分析物中的印跡分子與高聚物上的孔穴有特異性的吸附作用，從而達到將目標物從待測物中分離的目的，見圖2。

圖2 MMIPs合成示意圖Fig.2 Synthesis route of MMIPs

2.2 MMIPs吸附性能的測定

圖3 4 種偽蛋白吸附等溫曲線Fig.3 Binding isotherms of MMIPs and MNIP

通過靜態(tài)吸附實驗考察MMIPs對雙氰胺、縮二脲、三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪的吸附能力。制備磁性非分子印跡聚合物（magnetic non-molecular imprinted polymers，MNIP）時，除不加印跡分子外，其余步驟同1.3.2節(jié)。由圖3可知，隨著平衡濃度的增加，4 種偽蛋白被MMIPs吸附的含量顯著增加，MMIPs對雙氰胺、縮二脲、三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪均具有較好的特異性吸附能力。MMIPs和MNIP對4 種偽蛋白的吸附量具有顯著差異。這是由于MMIPs中形成了帶有與印記分子互補且空間上固定排列的分子印跡位點，當印記分子進入“孔穴”中時，與其中的官能團發(fā)生對應的結合作用，能夠更好地吸附目標分子。而對于MNIP來說，由于不具有特異性的印跡位點，其與底物產(chǎn)生結合作用屬于物理吸附，無規(guī)律性，所以MNIP的吸附量變化不顯著。

2.3 色譜條件與質譜條件的選擇

雙氰胺、縮二脲、三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪均屬于分子結構帶有氨基的有機胺類強極性化合物，所以使用ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱，親水相互作用色譜模式（HILIC模式）對其進行分離。電噴霧電離模式為正離子模式，故在流動相中加入甲酸加強目標化合物的質子化效果。但是實驗中發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸和乙腈作為流動相，進行梯度洗脫時化合物峰形和線性關系均不理想，分析原因或為流動相pH值過低，因此在流動相中引入緩沖鹽，使其保持相對穩(wěn)定的酸度。通過實驗發(fā)現(xiàn)，用含1%甲酸的5 mmol/L甲酸銨溶液和乙腈對待測物進行梯度洗脫時，線性關系良好、峰形明顯改善。

根據(jù)歐盟非強制執(zhí)行法案2002-657-EC[36]，液相色譜-串聯(lián)質譜進行物質鑒定時，物質的確認需要最少4 個識別點。采用多離子反應監(jiān)控模式，1 個母離子（1 個識別點），2 個子離子（每個1.5 個識別點），滿足法案要求。因為4 種化合物均含堿性基團氨基，理論上在電噴霧離子源正離子模式下更易得到較強的準分子離子信號，實驗中也證實了4 種化合物在電噴霧離子源正離子模式條件下[M+H]+信號最強。所以本實驗采用正離子掃描，[M+H]+作為準分子離子峰（表1）。為了提高測定結果的準確性，選用三聚氰胺-三胺-15N3作為內標化合物來校正由于樣品基體的干擾所帶來的質譜信號的偏離，由于均屬于帶有氨基的有機胺類化合物，可以最大限度地減少分析誤差。標準品和內標的多反應監(jiān)測色譜圖和的二級質譜圖見圖4。

圖4 多反應監(jiān)測色譜圖和的二級質譜圖Fig.4 MRM chromatograms and tandem mass spectra

2.4 提取條件的優(yōu)化

2.4.1 提取方式

雙氰胺、縮二脲、三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪均微溶于水，可溶于乙腈、甲醇等有機溶劑中，直接加入2 種MMIPs進行吸附，乳制品中大量的蛋白均會覆蓋2 種MMIPs的表面，會影響2 種MMIPs對目標化合物的吸附。故選擇乙腈-水（50∶50，V/V）預先除去大部分蛋白，再加入2 種MMIPs進行特異性吸附。

2.4.2 MMIPs的用量

在上述提取液（雙氰胺、縮二脲、三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪含量均為1 μg）中分別加入20、40、60、80、100、120、150、180、200 mg MMIPs，吸附完成后按照1.3.6節(jié)方法處理。結果顯示，當2 種MMIPs添加量在20～150 mg時，4 種化合物的回收率均隨著MMIPs添加量的增加而增加；當2 種MMIPs添加量大于150 mg時，4 種化合物的回收率不再增加。此4 種化合物的最小回收率為95.2%。由此得出添加150 mg 2 種MMIPs完全滿足樣品測定的需要。

2.4.3 提取時間的選擇

對不同吸附時間（1～15 min）的4 種化合物的回收率進行測定。當吸附時間在1～6 min時，此4 種化合物的平均回收率從35.1%增加到95.1%，當吸附時間大于6 min時，此4 種化合物的平均回收率沒有顯著增加，所以確定最佳吸附時間為6 min。

2.4.4 清洗溶劑的選擇

MMIPs吸附完成后首先需要清洗MMIPs表面雜質，然后將印跡孔穴中的目標化合物洗脫出來?？疾觳煌w積分數(shù)的甲醇溶液以及乙腈溶液，分別對MMIPs表面進行清洗，并對洗脫溶劑的體積進行優(yōu)化。結果表明，使用3 mL 10%甲醇溶液對MMIPs表面進行清洗，4 種化合物回收率均比較高。

2.4.5 洗脫溶劑的選擇

目標化合物（印跡分子）以較弱的氫鍵或離子作用等非共價鍵與MMIPs中的特異性空穴結合。一般采用乙腈、水、甲醇-乙酸、乙腈-乙酸等相對高極性溶劑反復洗脫，即可除去印跡分子。經(jīng)過比較實驗，本方法加入1 mL甲醇-乙酸（95∶5，V/V）溶液對4 種化合物進行洗脫，反復6 次。為了提高提取效率，洗脫時使用超聲波進行輔助提取。實驗結果表明，使用該洗脫方式，4 種目標化合物均可被完全洗脫。

2.5 樣品基質效應

為保證方法的通用性和適用性，本實驗研究基質對分析物信號的影響，以消除干擾。在乳制品中，由于配方復雜且蛋白質等物質的存在，離子抑制十分明顯。經(jīng)研究采用MMIPs進行凈化排除干擾物質，并結合清洗和洗脫，同時添加同位素內標抵消質譜離子化時的基質效應，從而消除了基質效應，乳粉加標樣品的色譜圖見圖5。

圖5 乳粉加標樣品提取離子色譜圖Fig.5 Extracted ion chromatogram of spiked milk powder sample

2.6 線性范圍及檢出限測定結果

按照1.3.5節(jié)方法配制一系列混合標準工作溶液，采用添加同位素內標物和空白樣品提取液稀釋配制標準工作液2 種方式相結合來減弱離子化時的基質效應，減小定量結果的偏差[17]。在選定的色譜條件和質譜條件下進行測定，以待測物質量濃度（X）為橫坐標，以標準品與內標物峰面積比（Y）為縱坐標繪制標準溶液工作曲線。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪、雙氰胺和縮二脲4 種偽蛋白各自的質量濃度與相應的峰面積比值（偽蛋白峰的面積/三聚氰胺-三胺-15N3峰面積）呈良好的線性關系，相關系數(shù)均達到0.999 0以上。

以1.3.6節(jié)方法處理添加目標化合物的空白樣品，按照選定的色譜條件和質譜條件進行測定，以3 倍信噪比為方法檢出限，以10 倍信噪比為方法定量限。其中檢出限1與定量限1為固體樣品的檢出限與定量限，檢出限2與定量限2為液體樣品的檢出限與定量限，見表2。

表2 方法的線性方程、線性范圍、相關系數(shù)、檢出限和定量限Table2 Linear equation, linear range, correlation coefficient, LOD and LOQ of the method

2.7 回收率和精密度測定結果

在不同種類的空白乳制品中添加不同水平的雙氰胺、縮二脲、三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪標準物質，其回收率、精密度結果見表3。結果顯示，雙氰胺的平均加標回收率為82.8%～95.5%，相對標準偏差為2.5%～9.2%；縮二脲的平均加標回收率為80.5%～94.2%，相對標準偏差為1.1%～7.2%；三聚氰胺的平均加標回收率為88.6%～95.6%，相對標準偏差為3.1%～6.9%；環(huán)丙氨嗪的平均加標回收率為83.5%～96.1%，相對標準偏差為2.1%～7.5%。

表3 不同乳制品中回收率與精密度實驗結果（n=6）Table3 Recovery and precision for 6 replicate determinations of four pseudo proteins in different samples (n= 6)

2.8 實際樣品測定結果

對市售的30 種乳制品進行分析測定，利用本方法對每個樣品重復測定3 次，結果表明三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪、雙氰胺和縮二脲含量均小于方法檢出限。

3 結 論

本實驗以縮二脲-13C2和環(huán)丙氨嗪-D4為印記分子，MAA為功能單體，EGDMA為交聯(lián)劑，F(xiàn)e3O4為磁性組分成功制備出對三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪、雙氰胺和縮二脲有特異選擇吸附性能MMIPs。此外，該聚合物具有很好的磁性，在完成對目標物的吸附后，可以在外加磁場作用下實現(xiàn)動態(tài)快速分離，使提取過程更加方便、快捷。應用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用技術，對提取出來的三聚氰胺、環(huán)丙氨嗪、雙氰胺和縮二脲進行色譜分離、定性、定量分析，其結果準確、可靠。