盧燕芳 ，李彬 ，林齊立 ，陳瑋媛 ，張婧玲

(1.福建省婦幼保健院檢驗科，福建 福州 350001；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院檢驗科，福建 福州 350001；3.福建醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)與技術(shù)工程學(xué)院，福建 福州350001)

Phoenix-100全自動微生物分析系統(tǒng)是臨床常用的全自動微生物鑒定與藥敏儀之一，可以快速高效地對多種微生物進行鑒定與藥敏分析，其高級專家系統(tǒng)（AES）更能提示菌株可能存在的耐藥機制，對臨床診療有重要的指導(dǎo)意義[1]。近年來，CRE菌株的出現(xiàn)給臨床抗感染治療帶來了極大的挑戰(zhàn)[2]，臨床微生物實驗室應(yīng)評價其所用的全自動微生物鑒定與藥敏儀對CRE的鑒定及預(yù)警功能，以降低漏檢率，防止耐藥菌株的流行[3]。本研究擬探討Phoenix-100全自動微生物分析系統(tǒng)在CRE鑒定及預(yù)警產(chǎn)碳青霉烯酶的可靠性和臨床價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 收集2011年8月3日至2012年8月3日某醫(yī)院臨床送檢樣本中分離并保存的93株非重復(fù)的碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌作為受試菌株。

1.1.2 儀器與試劑 Phoenix-100全自動微生物分析系統(tǒng)及相配套的細菌生化NMIC/ID4藥敏鑒定卡（購自美國BD公司）。

1.1.3 質(zhì)控菌株 產(chǎn)酸克雷伯菌ATCC700324、大腸埃希菌ATCC25922。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定與藥敏 將初篩的菌落移種至血平板上培養(yǎng)過夜，獲得單個純種菌落；將所獲菌株制成相應(yīng)麥?zhǔn)蠞岫鹊木涸赑hoenix-100全自動微生物分析系統(tǒng)進行鑒定藥敏分析，同時對儀器高級專家系統(tǒng)所提示的產(chǎn)酶信息進行統(tǒng)計分析。具體操作步驟參考儀器廠家提供的標(biāo)準(zhǔn)步驟。

1.2.2 耐藥基因的檢測 煮沸法提取細菌模板DNA，采用PCR特異性的引物序列[4]擴增常見的碳青霉烯耐藥基因 （如 blaKPC、blaIMP、blaVIM、blaNDM），測序PCR陽性產(chǎn)物以確定基因型。

1.2.3 Phoenix-100儀器AES性能指標(biāo)統(tǒng)計 以PCR法擴增碳青霉烯酶基因后的檢測結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，使用Phoenix-100全自動微生物分析系統(tǒng)對該基因型的碳青霉烯酶菌株數(shù)進行鑒定并對AES提示產(chǎn)酶情況的相關(guān)性能指標(biāo)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 CRE菌株分布和Phoenix-100鑒定情況 共篩選出碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌93株，其分布及Phoenix-100全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定情況見表1。Phoenix-100全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定CRE菌株的符合率為41.9%(39/93)，其中產(chǎn)酸克雷伯菌的符合率最高，為75.0%(3/4)。

表1 CRE菌株的分布和不同菌株中Phoenix-100鑒定情況

2.2 PCR和Phoenix-100 AES系統(tǒng)提示碳青霉烯酶陽性菌株情況 93株CRE中有55株攜帶碳青霉烯酶耐藥基因，而Phoenix-100 AES系統(tǒng)提示44株CRE產(chǎn)碳青霉烯酶，見表2。

2.3 PCR擴增碳青霉烯酶基因及測序結(jié)果 通過PCR擴增和測序分析，實驗菌株檢測出的碳青霉烯酶基因型分布見表3。在攜帶不同碳青霉烯酶基因型的55株CPE菌株中，Phoenix-100全自動微生物分析系統(tǒng)判定為CRE菌株的能力及AES提示產(chǎn)酶情況有所不同，見表4。

2.4 Phoenix-100 AES檢測碳青霉烯酶的參數(shù)指標(biāo) 以PCR擴增碳青霉烯酶基因及DNA測序結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，Phoenix-100全自動微生物分析系統(tǒng)檢測CRE菌株時，AES在提示產(chǎn)碳青霉烯酶方面靈敏度為52.7%，特異性為60.5%，陽性預(yù)測值為65.9%，陰性預(yù)測值為46.9%，準(zhǔn)確度為55.9%。參數(shù)指標(biāo)見表5。

表2 CRE菌株中PCR證實CPE和Phoenix-100提示碳青霉烯酶陽性菌株情況對比

3 討論

碳青霉烯類抗生素目前被認為是治療革蘭陰性菌感染的最后一道防線，而近年來，碳青霉烯類耐藥的腸桿菌科細菌所致感染爆發(fā)的報道呈現(xiàn)上升趨勢，給臨床抗感染治療帶來了嚴峻的挑戰(zhàn)[2]。為了解Phoenix-100鑒定CRE菌株的預(yù)警能力，本研究收集非重復(fù)臨床分離的CRE，以PCR結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，評價Phoenix-100全自動微生物分析系統(tǒng)在鑒定及預(yù)測CRE是否產(chǎn)碳青霉烯酶的可靠性，探討Phoenix-100全自動微生物分析系統(tǒng)檢測CRE的性能及預(yù)警中的指導(dǎo)價值和臨床意義。

表3 碳青霉烯酶基因型病原菌構(gòu)成比（%）

表4 Phoenix-100對不同碳青霉烯酶基因型菌株的判定和提示產(chǎn)酶情況

表5 Phoenix-100 AES檢測腸桿菌科細菌碳青霉烯酶的參數(shù)指標(biāo)

本研究收集的93株CRE菌株主要以肺炎克雷伯菌為主，與目前CRE菌株的研究分布相符[4，5]。本研究發(fā)現(xiàn)大量的IMP型碳青霉烯酶基因已在多種腸桿菌科細菌中播散，應(yīng)引起高度重視。本研究中Phoenix-100對不同菌種CRE預(yù)測能力均較低，這與李春娟等[6]的實驗結(jié)果有較大出入，這可能與不同地域中CRE菌株對亞胺培南或美羅培南的耐藥率不同有關(guān)。

以PCR為金標(biāo)準(zhǔn)，Phoenix-100 AES篩檢碳青霉烯酶陽性的符合率也較低，可能由于一部分產(chǎn)誘導(dǎo)酶的細菌及延遲表達耐藥性的細菌在短時間內(nèi)難達到可檢測水平而造成Phoenix-100儀器漏報耐藥結(jié)果，且儀器對菌懸液的濃度要求相當(dāng)嚴格，稍微誤差則有可能會不報結(jié)果。然而在預(yù)測大腸埃希菌是否為碳青霉烯酶陽性時，Phoenix-100 AES系統(tǒng)的陽性提示率反而高于PCR對碳青霉烯酶的檢出率（見表2），可能與Phoenix-100僅是表型監(jiān)測，而一些如生長溫度、PH值等非基因因素導(dǎo)致的假陽性影響檢出率有關(guān)，又或許與PCR未能檢出少見碳青霉烯酶基因 （如blaIMI，blaVIM等）有關(guān)。

本實驗顯示Phoenix-100對不同基因型的CRE菌株的預(yù)測率不同（見表4），對blaKPC-2與blaNDM-1基因型的CRE預(yù)測率遠遠高于blaIMP-4及blaIMP-8基因型?？赡芘c本研究收集的菌株中blaKPC-2與blaNDM-1基因型的CRE的菌株數(shù)量較少有關(guān)，必要的時候可以增加CRE菌株的數(shù)量與菌屬總類進一步確認Phoenix-100全自動微生物分析系統(tǒng)判定CRE的性能。此外，在判定攜帶blaIMP-4的CRE菌株時，Phoenix-100 AES的陽性提示率高于儀器對CRE的直接鑒定（見表4）。導(dǎo)致該現(xiàn)象的可能原因與菌株復(fù)雜的耐藥表型而造成Phoenix-100 AES的誤判有關(guān)。因此，Phoenix-100全自動微生物分析系統(tǒng)可結(jié)合如PCR的方法以提高對產(chǎn)酶株檢測的準(zhǔn)確率。

本結(jié)果顯示Phoenix-100全自動微生物分析系統(tǒng)對碳青霉烯類耐藥的腸桿菌科細菌的鑒定及預(yù)警能力不足，可能是由于本儀器僅有美羅培南和亞胺培南兩種藥敏卡片，而并沒有厄他培南卡片。但是CLSI推薦[7]使用厄他培南紙片是檢測CRE最好的藥敏紙片，本儀器缺少的厄他培南藥敏信息可能是其鑒定CRE的指導(dǎo)價值低的原因。

綜上所述，Phoenix-100全自動微生物分析系統(tǒng)預(yù)測CRE菌株的靈敏度較低，對于工作中使用本儀器的臨床微生物實驗室筆者建議必要時應(yīng)輔以聯(lián)用厄他培南紙片擴散法，以提高CRE的檢出率，以便臨床根據(jù)病原菌的種類以及藥敏試驗結(jié)果及時制定有效且合理的治療方案，來減少產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的出現(xiàn)和流行。