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2019-02-06 07:22:06王金晶鄭飛云劉春鳳李永仙鈕成拓
食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào) 2019年10期
楊 歌，王金晶，李 佳，鄭飛云，劉春鳳，李永仙，鈕成拓，李 崎*
（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 釀酒科學(xué)與工程研究室，江蘇無(wú)錫 214122）
釀酒酵母與人類(lèi)的生活息息相關(guān)，并被譽(yù)為工業(yè)上最重要的微生物之一，它在發(fā)酵、烘焙、釀造、藥物和化工生產(chǎn)中有著重要的作用，尤其在啤酒行業(yè)，釀酒酵母對(duì)啤酒的質(zhì)量起決定性的作用[1-2]。釀酒酵母在發(fā)酵過(guò)程中受到來(lái)自發(fā)酵環(huán)境和工藝操作的脅迫，酵母細(xì)胞需要應(yīng)對(duì)高滲透壓、乙醇的積累和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏等壓力[3-4]，這些壓力可能降低釀酒酵母酵母活性、促進(jìn)細(xì)胞的自溶甚至死亡[5]。釀酒酵母的自溶對(duì)啤酒的質(zhì)量包括啤酒的風(fēng)味和品質(zhì)有嚴(yán)重的負(fù)面影響[6-7]。因此，提高釀酒酵母的壓力耐受性對(duì)發(fā)酵行業(yè)、工業(yè)等都存在重大意義。
酵母細(xì)胞壁作為保護(hù)細(xì)胞的第一層屏障，主要的作用是維持內(nèi)部滲透壓、保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械壓力的破壞以及維持酵母的細(xì)胞形態(tài)等[8-9]。酵母細(xì)胞壁是雙層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，主要由電子透明的內(nèi)層和電子不透明的外層構(gòu)成，幾丁質(zhì)和β-葡聚糖構(gòu)成內(nèi)層物質(zhì)，甘露聚糖構(gòu)成外層物質(zhì)[10-11]。其中β-葡聚糖由1，3-β-葡聚糖（80%～90%）和1，3-β-葡聚糖（10%～20%）構(gòu)成，是細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)重要的基礎(chǔ)單元。1，3-β-葡聚糖螺旋結(jié)構(gòu)使細(xì)胞壁靈活多變、一定的彈性以及較強(qiáng)的拉伸強(qiáng)度[12]。催化合成1，3-β-葡聚糖最主要的酶是1，3-β-葡聚糖合成酶（1，3-β-glucan synthase，GS）[13]。GS 中兩個(gè)相似度為88%的催化亞基是Fks1p、Fksp2 分別由FKS1 和FKS2 催化合成，F(xiàn)ks3p 與Fks1p 有56%的同源性[14-15]。研究人員通過(guò)過(guò)表達(dá)FKS1 基因，發(fā)現(xiàn)突變菌株的耐受性和抗自溶能力均高于原始菌株[16]。另有研究報(bào)道FKS3 基因敲除菌株所產(chǎn)生的芽孢對(duì)溫度、乙醇等的抗性發(fā)生改變，F(xiàn)ks3p 會(huì)影響芽孢的生殖，但是其作用機(jī)制尚不清楚[17-18]。FKS 家族基因?qū)?xì)胞壁的代謝合成及細(xì)胞耐受能力有一定協(xié)調(diào)的作用。
本研究通過(guò)同源重組的方法，構(gòu)建了三株FKS家族基因缺陷菌株，對(duì)比了重組菌株和原始菌株環(huán)境抗逆性、酵母細(xì)胞活性、合成乙醇能力等，為研究釀酒酵母耐受性及選育優(yōu)良耐受性的釀酒酵母提供理論基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 本研究所用質(zhì)粒及菌株 本研究所用的質(zhì)粒和菌株如表1 所示。
表1 本研究所用所用質(zhì)粒和菌株Table 1 Strains and plasmids used in this study
1.1.2 培養(yǎng)基及試劑
1）LB 培養(yǎng)基：氯化鈉10 g/L，酵母提取物5 g/L，胰蛋白胨10 g/L。篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子時(shí)加入Amp 150 μg/mL，固體培養(yǎng)基添加瓊脂量為18～20 g/L。
2）YPD 培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母提取物10 g/L 胰蛋白胨20 g/L。篩選轉(zhuǎn)化子時(shí)需添加G418 至200 μg/mL，固體培養(yǎng)基添加瓊脂量為18～20 g/L。
3）環(huán)境脅迫抗性平板：在YPD 平板上填加無(wú)水乙醇至8%濃度、NaCl 至0.4 mol/L 濃度。
4）麥汁培養(yǎng)基：將經(jīng)過(guò)糖化工藝的麥汁過(guò)濾后煮沸60～80 min。并添加酒花，添加量為0.3 g/L，酒花分三次加入，剛煮沸時(shí)加入1/2，煮沸30 min 添加1/4，煮沸前10 min 添加1/4。
5）檸檬酸鹽緩沖液：檸檬酸10.5 g/L，檸檬酸三鈉14.7 g/L，用1 mol/L 檸檬酸溶液調(diào)至pH=4.0。
Amipicillin、IPTG Dioxane Free（IPTG）與Magenta-Gal（X-Gal）購(gòu)自生工生物（上海）股份有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒與膠純化試劑盒均購(gòu)自美國(guó)歐米茄公司；克隆載體pMD 19T-simple、T4DNA 連接酶、感受態(tài)細(xì)胞制作試劑盒均購(gòu)自TaKaRa 公司；G418 購(gòu)自TIANGEN 生化科技有限公司；其他實(shí)驗(yàn)用試劑均購(gòu)自Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.公司。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 基因克隆及質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)pUG6 質(zhì)粒的序列以及SGD 公布的FKS家族基因序列，引物序列如表2 所示。以pUG6 質(zhì)粒為模板，表2 所示序列為引物，通過(guò)PCR 分別擴(kuò)增含有KanMX 基因和FKS1、FKS2、FKS3 同源臂的目的基因片段（中斷盒），將PCR 產(chǎn)物回收純化后的與載體pMD 19Tsimple TA 連接得到重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒構(gòu)建流程如圖1 所示，將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109 中保存。
表2 敲除盒擴(kuò)增引物Table 2 Primers for amplification of disruption cassettes
將得到重組質(zhì)粒按照醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到原始菌株W303 中，為能達(dá)到高效的同源重組，設(shè)計(jì)引物中兩個(gè)核苷酸序列之間同源序列為50 bp 左右[20]。轉(zhuǎn)化后先涂布到Y(jié)PD 平板上，在28 ℃條件下，培養(yǎng)至肉眼可見(jiàn)菌菌落，采用平板影印法影印到含有200 μg/mL G418 的平板上，對(duì)長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證所需引物如表3 所示。
1.2.2 酵母生長(zhǎng)性能分析 將原始菌株和重組菌株活化后以轉(zhuǎn)接至200 mL YPD 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)中，接種后的菌濃約為106個(gè)/mL。28 ℃180 r/min掊養(yǎng)。在此培養(yǎng)過(guò)程中每2 h 取一次樣品，吸光光度法測(cè)定菌液在560 nm 下的吸光值，并繪制生長(zhǎng)曲線。
1.2.3 酵母細(xì)胞壁多糖分析 培養(yǎng)收集酵母泥5 g，加入100 mL 醋酸鋰-SDS 溶液（醋酸鋰50 mmol/L，SDS 0.034 mol/L）溶液，在70℃水浴溫育10 min，每隔2.5 min 將三角瓶?jī)?nèi)的液體搖勻。將提取液在5 000 r/min 下離心10 min，除去菌體碎片。將上清液收集后，用1 倍體積的95%乙醇在4℃沉淀多糖[21]。加入75 μL 72%（w：v）濃硫酸，20～25 ℃放置3 h，中間間隔一定時(shí)間混合體系。3 h 后，加入950 μL 純水稀釋濃硫酸至1 mol/L 硫酸，準(zhǔn)確沸水浴4 h。反應(yīng)結(jié)束后，滴加飽和Ba（OH）2至中性，4 ℃靜止過(guò)夜，第2 天測(cè)定溶液pH 在6～9 之間可進(jìn)行下一步反應(yīng)。離心去除沉淀，調(diào)整體積至20 mL[21]。將細(xì)胞壁酸解液稀釋至適合濃度，經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾后上高效離子色譜進(jìn)行分離檢測(cè)。
圖1 重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖Fig.1 Construction of the recombinant plasmid
表3 重組菌驗(yàn)證引物Table 3 Primers for verified transformants
1.2.4 酵母抗脅迫能力分析 抗性平板分析：對(duì)原始菌株和重組菌株的各項(xiàng)耐壓性能的評(píng)價(jià)是根據(jù)菌體在不同壓力YPD 平板上的生長(zhǎng)情況。將菌種活化后，取5 mL 菌液轉(zhuǎn)移到30 mL YPD 培養(yǎng)基中，饑餓培養(yǎng)則接入相同體積的無(wú)菌水中培養(yǎng)6 h。收集菌體并用無(wú)菌水洗滌兩次，用血球計(jì)數(shù)板鏡檢計(jì)數(shù)，根據(jù)稀釋倍數(shù)比例，調(diào)節(jié)菌體濃度為107個(gè)/mL，10 倍梯度稀釋?zhuān)来稳?.5 μL 菌液點(diǎn)種在含有8%（v/v）乙醇、0.4 mol/L NaCl 的抗性平板上，培養(yǎng)2～3 d，觀察生長(zhǎng)情況。
1.2.5 液體發(fā)酵抗性分析 在斜面上取一環(huán)菌接種于10 mL 麥汁培養(yǎng)基中，活化36 h，在9 mL 麥汁試管接入1 mL 菌液，活化48 h，將全部菌液接入70 mL三角瓶中于培養(yǎng)48 h，所有活化溫度都為28 ℃。離心收集酵母泥，按照0.5%（w/v）的比例接入300 mL厭氧瓶中于28 ℃下發(fā)酵，在發(fā)酵第3，7 d 和12 d分別取樣。
1）測(cè)定酵母死亡率，取得的樣品與亞甲基紫染色液混合，染色5 min，將混合液滴在血球計(jì)數(shù)板上鏡檢計(jì)數(shù)。紅色為死亡細(xì)胞，無(wú)色為活細(xì)胞，計(jì)數(shù)并計(jì)算酵母死亡率。酵母死亡率計(jì)算公式如下
2）將收集的發(fā)酵液離心收集菌體，2.5%的戊二醛固定后，用掃描電鏡（SEM）進(jìn)行細(xì)胞顯微學(xué)在6 000 的倍數(shù)下觀察細(xì)胞形太。
3）發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定發(fā)酵液酒精度。
2 結(jié)果與分析
2.1 FKS1、FKS2 和FKS3 基因缺失型菌株的構(gòu)建
將該基因中斷盒轉(zhuǎn)化入原始菌株W303，通過(guò)同源重組法用KanMX 替換FKS1 基因，從而敲除FKS1 基因。將得到的轉(zhuǎn)化子提取基因組，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖2 所示，圖2（a）設(shè)計(jì)引物是FKS1 基因上游同源臂和KanMX 之間的序列，擴(kuò)增的是陽(yáng)性結(jié)果為1 213 bp；圖2（b）設(shè)計(jì)引物是擴(kuò)增FKS1基因上下游同源臂之間的序列。重組菌PCR 結(jié)果為2 100 bp，原始菌株結(jié)果為5 844 bp，不添加模板結(jié)果為空白，驗(yàn)證結(jié)果符合理論值，構(gòu)建的重組菌命名為fks1-QT。
圖2 P CR 驗(yàn)證重組菌中fks1-QT 中FKS1 基因敲除Fig.2 PCR verification of the FKS1 knocked-out in fks1-QT strain
同樣的分子操作構(gòu)建FKS2 和FKS3 缺陷型菌株。FKS2 和FKS3 缺陷菌株的基因組分別DNA 用F2-UF/F2-UR、F2-DF/F2-DR 和F3-UF/F3-UR、F3-DF/F3-DR 引物對(duì)進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，結(jié)果如圖3和圖4 所示，驗(yàn)證結(jié)果符合理論值，將重組菌株命名為fks2-QT 和fks3-QT。
圖3 P CR 驗(yàn)證重組菌中fks2-QT 中FKS2 基因敲除Fig.3 PCR verification of the FKS2 knocked-out in fks2-QT strain
圖4 P CR 驗(yàn)證重組菌中fks3-QT 中FKS3 基因敲除Fig.4 PCR verification of the FKS3 knocked-out in fks3-QT strain
2.2 重組菌生長(zhǎng)性能分析
酵母的生長(zhǎng)活性對(duì)酵母的工業(yè)應(yīng)用有重要作用，圖5 所示為各重組菌株與原始菌的生長(zhǎng)曲線，由圖5 可知，重組菌株fks2-QT 和fks3-QT 的生長(zhǎng)速度和原始菌株W303 差異不大，而重組菌種fks1-QT 的生長(zhǎng)速度始終慢于原始菌株。FKS1 基因是合成細(xì)胞壁葡聚糖酶的關(guān)鍵基因，敲除FKS1 基因的菌株合成酵母細(xì)胞壁葡聚糖的能力減弱，酵母細(xì)胞壁的正常代謝功能受到影響，從而影響酵母的生長(zhǎng)。FKS2 基因?qū)铣杉?xì)胞壁葡聚糖有一定影響較小，F(xiàn)KS2 基因的缺失并沒(méi)有影響酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)。FKS3 對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)并無(wú)太大影響。因此，F(xiàn)KS1基因?qū)S持酵母細(xì)胞活性有一定作用，F(xiàn)KS1 基因的缺陷導(dǎo)致細(xì)胞的生長(zhǎng)速度減緩，F(xiàn)KS2、FKS3 基因?qū)湍傅纳L(zhǎng)率沒(méi)有明顯的影響作用。
圖5 重組菌株和原始菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.5 Growth curves of the recombination strains and wild type strain
2.3 不同菌株細(xì)胞壁多糖含量的分析
重組菌株和原始菌株酵母細(xì)胞壁多糖的含量如圖6 所示，重組菌株fks1-QT（1.77±0.11）mg/g，3-β-葡聚糖的含量相對(duì)于原始菌株W303（3.44±0.097）mg/g 降低了約60%。重組菌 株fks2-QT（2.76±0.13）mg/g 和fks3-QT（3.10±0.15）mg/g 的1，3-β-葡聚糖的含量相對(duì)于原始菌株W303 分別降低了19.5%和3.8%，變化程度不大。FKS1 基因的缺失導(dǎo)致酵母菌株細(xì)胞壁1，3-β-葡聚糖的含量大幅度降低。FKS2 基因缺失導(dǎo)致酵母菌株細(xì)胞壁1，3-β-葡聚糖的含量明顯降低，F(xiàn)KS2 基因?qū)图?xì)胞壁葡聚有影響但作用不大。FKS3 基因缺失對(duì)酵母菌株細(xì)胞壁1，3-β-葡聚糖的含量并無(wú)太大影響。
重組菌株fks1-QT 細(xì)胞壁中甘露聚糖的含量為（3.42±0.10）mg/g，相對(duì)于原始菌株W303（2.81±0.09）mg/g 增加了17.8%，重組菌株fks2-QT 和fks3-QT 細(xì)胞壁甘露聚糖的含量相對(duì)W303 有一定程度減少。重組菌株fks1-QT（0.28±0.04）mg/g 細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)相對(duì)于原始菌株W303（0.12±0.03）mg/g增加了57.1%，重組菌株fks2-QT 和fks3-QT 細(xì)胞壁幾丁質(zhì)的含量相對(duì)W303 沒(méi)有太大變化。突變菌株細(xì)胞壁中1，3-β-葡聚糖的含量都有不同程度的降低，酵母細(xì)胞壁成分是動(dòng)態(tài)的，為了維持細(xì)胞壁完整性，其他多糖會(huì)隨之產(chǎn)生變化。
圖6 細(xì)胞壁多糖含量Fig.6 Content of polysaccharides in cell wall
2.4 抗環(huán)境脅迫能力分析
酵母菌株在工業(yè)應(yīng)用中要面對(duì)發(fā)酵液中環(huán)境的壓力，是反映酵母性能的重要指標(biāo)。原始菌株和重組菌株對(duì)滲透壓、酒精濃度以及對(duì)饑餓的抗性如圖7 所示：在含有0.5 NaCl mg/g 及饑餓培養(yǎng)條件下，原始菌株W303 的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)最明顯，而重組菌株fks1-QT 的生長(zhǎng)性能最差，而在在10%乙醇的環(huán)境壓力下，原始菌株W303 的抗性最差。酵母細(xì)胞壁有抵抗外界滲透壓的作用，細(xì)胞1，3-β-葡聚糖的含量減少，導(dǎo)致酵母細(xì)胞細(xì)胞壁抵抗外界滲透壓能力變?nèi)?，突變菌株在在含?.5 NaCl mg/g 的條件下生產(chǎn)性能較差。細(xì)胞壁1，3-β-葡聚糖的含量減少導(dǎo)致突變菌尤其是FKS1 基因缺失菌株對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力變?nèi)?，在饑餓培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)狀況較差。在10%乙醇環(huán)境壓力下，原始菌株的生長(zhǎng)狀況較差。該結(jié)論可以證明，F(xiàn)KS 家族基因?qū)?xì)胞抗?jié)B透壓和饑餓的能力有重要作用，而對(duì)抗酒精脅迫的能力有負(fù)面影響。
2.5 酵母液體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)
圖7 不同菌株在抗性平板上的生長(zhǎng)狀況Fig.7 Different strains growth condition in stressful environment
為判斷不同菌株在啤酒發(fā)酵條件下的狀況，將菌株置于麥汁培養(yǎng)基中發(fā)酵，模擬發(fā)酵環(huán)境。分別于第2、7 和12 天取發(fā)酵液，測(cè)定酵母死亡率，并掃描電鏡觀察酵母的形態(tài)（圖8）。如表4 所示，第2 天不同菌株的死亡率差異不大，酵母細(xì)胞的形態(tài)都是飽滿、圓潤(rùn)、沒(méi)有破損的，隨著時(shí)間的推移不同菌株酵母的死亡率差異越大。第12 天時(shí)，fks1-QT 菌株的死亡率最高，觀察SEM 圖片，細(xì)胞出現(xiàn)較大范圍的自溶狀況，細(xì)胞內(nèi)容物流出，嚴(yán)重干癟變形。fks2-QT 菌株的死亡率與原始菌株W303 接近，且與原始菌株W303 相同部分酵母開(kāi)始有破損，小范圍的酵母出現(xiàn)自溶狀況。重組菌株fks3-QT 的死亡率低，并且低于原始菌株W303 的死亡率，細(xì)胞依舊圓潤(rùn)，比較完整，良好的抵抗外界壓力。由此證明，F(xiàn)KS1 基因通過(guò)控制對(duì)細(xì)胞壁的完整性對(duì)抵抗發(fā)酵環(huán)境的壓力有重要的作用，F(xiàn)KS3 基因?qū)?xì)胞抵抗發(fā)酵環(huán)境的壓力作用有負(fù)面作用。
表4 細(xì)胞在發(fā)酵液中的死亡率Table 4 Mortality rate of yeast cells in the fermentation broth
圖8 原始菌株和重組菌株的掃描電鏡（SEM）分析Fig.8 SEM analysis of wild type strain and mutant strains
2.6 FKS 家族基因?qū)湍负铣梢掖寄芰Φ挠绊?/h3>
模式菌株W303 不具備工業(yè)酵母良好的發(fā)酵性能，但有完整的合成乙醇的途徑，測(cè)定重組菌株和原始菌株的酒精度，可反映FKS 家族基因?qū)湍讣?xì)胞合成乙醇的影響，對(duì)工業(yè)酵母有一定的指導(dǎo)意義。經(jīng)過(guò)15 d 的發(fā)酵后測(cè)定發(fā)酵液的酒精度（圖9），重組菌株fks3-QT（1.53±0.031）%的酒精度最高，之后依次為W303（1.23±0.032）%、fks2-QT（0.85±0.031）%、fks1-QT（0.485±0.031）%。根據(jù)2.5節(jié)的分析FKS 家族基因?qū)湍傅幕钚浴?duì)外界環(huán)境的耐壓性有不同的影響，抗發(fā)酵環(huán)境壓力強(qiáng)的菌株fks3-QT 活性更強(qiáng)導(dǎo)致發(fā)酵合成的乙醇濃度最高，抗發(fā)酵環(huán)境壓力較弱的菌株fks1-QT 活性更弱導(dǎo)致發(fā)酵合成的乙醇濃度最低。因此，F(xiàn)KS 家族基因通過(guò)影響酵母在發(fā)酵時(shí)的細(xì)胞狀態(tài)，從而影響酵母合成乙醇的能力。
圖9 不同菌株發(fā)酵酒精度Fig.9 Fermentation liquid alcohol of different strains
3 結(jié)語(yǔ)
酵母抵抗外界環(huán)境的壓力對(duì)酵母在發(fā)酵工業(yè)中，尤其是啤酒行業(yè)的生產(chǎn)起著關(guān)鍵的作用。了解酵母抗壓力機(jī)制，對(duì)選育強(qiáng)壯的酵母有重要的指導(dǎo)作用。酵母也常被用來(lái)作為模式生物研究真核細(xì)胞的遺傳學(xué)和生理學(xué)，但是多倍體酵母中，多位基因存在時(shí)在基因改良過(guò)程中有可能發(fā)生回復(fù)突變[23]，單倍體W303 模式菌株則可以避免這些問(wèn)題。
本研究運(yùn)用生物學(xué)手段得到FKS 家族基因單個(gè)敲除的重組菌株，比較原始菌株和重組菌種的生長(zhǎng)狀況、細(xì)胞壁多糖含量、抗脅迫能力以及在發(fā)酵環(huán)境下的死亡率等。發(fā)現(xiàn)重組菌株fks1-QT 細(xì)胞壁1，3-β-葡聚糖相對(duì)于原始菌株W303 的含量降低了60%，且生長(zhǎng)性能較差，但抗酒精脅迫抗性更強(qiáng)，而滲透壓和饑餓耐受性較差，在發(fā)酵環(huán)境中也更容易死亡。重組菌種fks2-QT 細(xì)胞壁中β-葡聚糖的含量略低于原始菌株W303，其他生理形狀與原始菌株相差不大。重組菌株fks3-QT 在發(fā)酵環(huán)境中的死亡率低于原始菌株，SEM 電鏡中fks3-QT 的狀態(tài)、酒精代謝活性也優(yōu)于原始菌株，因此FKS1 基因?qū)湍妇S持細(xì)胞耐受性、保證細(xì)胞正常生長(zhǎng)有重要的作用，而FKS3 基因?qū)湍改褪苄杂胸?fù)面作用，但其作用機(jī)理仍待研究。
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楊 歌，王金晶，李 佳，鄭飛云，劉春鳳，李永仙，鈕成拓，李 崎*
（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué) 釀酒科學(xué)與工程研究室，江蘇無(wú)錫 214122）
釀酒酵母與人類(lèi)的生活息息相關(guān)，并被譽(yù)為工業(yè)上最重要的微生物之一，它在發(fā)酵、烘焙、釀造、藥物和化工生產(chǎn)中有著重要的作用，尤其在啤酒行業(yè)，釀酒酵母對(duì)啤酒的質(zhì)量起決定性的作用[1-2]。釀酒酵母在發(fā)酵過(guò)程中受到來(lái)自發(fā)酵環(huán)境和工藝操作的脅迫，酵母細(xì)胞需要應(yīng)對(duì)高滲透壓、乙醇的積累和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏等壓力[3-4]，這些壓力可能降低釀酒酵母酵母活性、促進(jìn)細(xì)胞的自溶甚至死亡[5]。釀酒酵母的自溶對(duì)啤酒的質(zhì)量包括啤酒的風(fēng)味和品質(zhì)有嚴(yán)重的負(fù)面影響[6-7]。因此，提高釀酒酵母的壓力耐受性對(duì)發(fā)酵行業(yè)、工業(yè)等都存在重大意義。
酵母細(xì)胞壁作為保護(hù)細(xì)胞的第一層屏障，主要的作用是維持內(nèi)部滲透壓、保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械壓力的破壞以及維持酵母的細(xì)胞形態(tài)等[8-9]。酵母細(xì)胞壁是雙層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，主要由電子透明的內(nèi)層和電子不透明的外層構(gòu)成，幾丁質(zhì)和β-葡聚糖構(gòu)成內(nèi)層物質(zhì)，甘露聚糖構(gòu)成外層物質(zhì)[10-11]。其中β-葡聚糖由1，3-β-葡聚糖（80%～90%）和1，3-β-葡聚糖（10%～20%）構(gòu)成，是細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)重要的基礎(chǔ)單元。1，3-β-葡聚糖螺旋結(jié)構(gòu)使細(xì)胞壁靈活多變、一定的彈性以及較強(qiáng)的拉伸強(qiáng)度[12]。催化合成1，3-β-葡聚糖最主要的酶是1，3-β-葡聚糖合成酶（1，3-β-glucan synthase，GS）[13]。GS 中兩個(gè)相似度為88%的催化亞基是Fks1p、Fksp2 分別由FKS1 和FKS2 催化合成，F(xiàn)ks3p 與Fks1p 有56%的同源性[14-15]。研究人員通過(guò)過(guò)表達(dá)FKS1 基因，發(fā)現(xiàn)突變菌株的耐受性和抗自溶能力均高于原始菌株[16]。另有研究報(bào)道FKS3 基因敲除菌株所產(chǎn)生的芽孢對(duì)溫度、乙醇等的抗性發(fā)生改變，F(xiàn)ks3p 會(huì)影響芽孢的生殖，但是其作用機(jī)制尚不清楚[17-18]。FKS 家族基因?qū)?xì)胞壁的代謝合成及細(xì)胞耐受能力有一定協(xié)調(diào)的作用。
本研究通過(guò)同源重組的方法，構(gòu)建了三株FKS家族基因缺陷菌株，對(duì)比了重組菌株和原始菌株環(huán)境抗逆性、酵母細(xì)胞活性、合成乙醇能力等，為研究釀酒酵母耐受性及選育優(yōu)良耐受性的釀酒酵母提供理論基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 本研究所用質(zhì)粒及菌株 本研究所用的質(zhì)粒和菌株如表1 所示。
表1 本研究所用所用質(zhì)粒和菌株Table 1 Strains and plasmids used in this study
1.1.2 培養(yǎng)基及試劑
1）LB 培養(yǎng)基：氯化鈉10 g/L，酵母提取物5 g/L，胰蛋白胨10 g/L。篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子時(shí)加入Amp 150 μg/mL，固體培養(yǎng)基添加瓊脂量為18～20 g/L。
2）YPD 培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母提取物10 g/L 胰蛋白胨20 g/L。篩選轉(zhuǎn)化子時(shí)需添加G418 至200 μg/mL，固體培養(yǎng)基添加瓊脂量為18～20 g/L。
3）環(huán)境脅迫抗性平板：在YPD 平板上填加無(wú)水乙醇至8%濃度、NaCl 至0.4 mol/L 濃度。
4）麥汁培養(yǎng)基：將經(jīng)過(guò)糖化工藝的麥汁過(guò)濾后煮沸60～80 min。并添加酒花，添加量為0.3 g/L，酒花分三次加入，剛煮沸時(shí)加入1/2，煮沸30 min 添加1/4，煮沸前10 min 添加1/4。
5）檸檬酸鹽緩沖液：檸檬酸10.5 g/L，檸檬酸三鈉14.7 g/L，用1 mol/L 檸檬酸溶液調(diào)至pH=4.0。
Amipicillin、IPTG Dioxane Free（IPTG）與Magenta-Gal（X-Gal）購(gòu)自生工生物（上海）股份有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒與膠純化試劑盒均購(gòu)自美國(guó)歐米茄公司；克隆載體pMD 19T-simple、T4DNA 連接酶、感受態(tài)細(xì)胞制作試劑盒均購(gòu)自TaKaRa 公司；G418 購(gòu)自TIANGEN 生化科技有限公司；其他實(shí)驗(yàn)用試劑均購(gòu)自Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.公司。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 基因克隆及質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)pUG6 質(zhì)粒的序列以及SGD 公布的FKS家族基因序列，引物序列如表2 所示。以pUG6 質(zhì)粒為模板，表2 所示序列為引物，通過(guò)PCR 分別擴(kuò)增含有KanMX 基因和FKS1、FKS2、FKS3 同源臂的目的基因片段（中斷盒），將PCR 產(chǎn)物回收純化后的與載體pMD 19Tsimple TA 連接得到重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒構(gòu)建流程如圖1 所示，將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109 中保存。
表2 敲除盒擴(kuò)增引物Table 2 Primers for amplification of disruption cassettes
將得到重組質(zhì)粒按照醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到原始菌株W303 中，為能達(dá)到高效的同源重組，設(shè)計(jì)引物中兩個(gè)核苷酸序列之間同源序列為50 bp 左右[20]。轉(zhuǎn)化后先涂布到Y(jié)PD 平板上，在28 ℃條件下，培養(yǎng)至肉眼可見(jiàn)菌菌落，采用平板影印法影印到含有200 μg/mL G418 的平板上，對(duì)長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證所需引物如表3 所示。
1.2.2 酵母生長(zhǎng)性能分析 將原始菌株和重組菌株活化后以轉(zhuǎn)接至200 mL YPD 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)中，接種后的菌濃約為106個(gè)/mL。28 ℃180 r/min掊養(yǎng)。在此培養(yǎng)過(guò)程中每2 h 取一次樣品，吸光光度法測(cè)定菌液在560 nm 下的吸光值，并繪制生長(zhǎng)曲線。
1.2.3 酵母細(xì)胞壁多糖分析 培養(yǎng)收集酵母泥5 g，加入100 mL 醋酸鋰-SDS 溶液（醋酸鋰50 mmol/L，SDS 0.034 mol/L）溶液，在70℃水浴溫育10 min，每隔2.5 min 將三角瓶?jī)?nèi)的液體搖勻。將提取液在5 000 r/min 下離心10 min，除去菌體碎片。將上清液收集后，用1 倍體積的95%乙醇在4℃沉淀多糖[21]。加入75 μL 72%（w：v）濃硫酸，20～25 ℃放置3 h，中間間隔一定時(shí)間混合體系。3 h 后，加入950 μL 純水稀釋濃硫酸至1 mol/L 硫酸，準(zhǔn)確沸水浴4 h。反應(yīng)結(jié)束后，滴加飽和Ba（OH）2至中性，4 ℃靜止過(guò)夜，第2 天測(cè)定溶液pH 在6～9 之間可進(jìn)行下一步反應(yīng)。離心去除沉淀，調(diào)整體積至20 mL[21]。將細(xì)胞壁酸解液稀釋至適合濃度，經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾后上高效離子色譜進(jìn)行分離檢測(cè)。
圖1 重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖Fig.1 Construction of the recombinant plasmid
表3 重組菌驗(yàn)證引物Table 3 Primers for verified transformants
1.2.4 酵母抗脅迫能力分析 抗性平板分析：對(duì)原始菌株和重組菌株的各項(xiàng)耐壓性能的評(píng)價(jià)是根據(jù)菌體在不同壓力YPD 平板上的生長(zhǎng)情況。將菌種活化后，取5 mL 菌液轉(zhuǎn)移到30 mL YPD 培養(yǎng)基中，饑餓培養(yǎng)則接入相同體積的無(wú)菌水中培養(yǎng)6 h。收集菌體并用無(wú)菌水洗滌兩次，用血球計(jì)數(shù)板鏡檢計(jì)數(shù)，根據(jù)稀釋倍數(shù)比例，調(diào)節(jié)菌體濃度為107個(gè)/mL，10 倍梯度稀釋?zhuān)来稳?.5 μL 菌液點(diǎn)種在含有8%（v/v）乙醇、0.4 mol/L NaCl 的抗性平板上，培養(yǎng)2～3 d，觀察生長(zhǎng)情況。
1.2.5 液體發(fā)酵抗性分析 在斜面上取一環(huán)菌接種于10 mL 麥汁培養(yǎng)基中，活化36 h，在9 mL 麥汁試管接入1 mL 菌液，活化48 h，將全部菌液接入70 mL三角瓶中于培養(yǎng)48 h，所有活化溫度都為28 ℃。離心收集酵母泥，按照0.5%（w/v）的比例接入300 mL厭氧瓶中于28 ℃下發(fā)酵，在發(fā)酵第3，7 d 和12 d分別取樣。
1）測(cè)定酵母死亡率，取得的樣品與亞甲基紫染色液混合，染色5 min，將混合液滴在血球計(jì)數(shù)板上鏡檢計(jì)數(shù)。紅色為死亡細(xì)胞，無(wú)色為活細(xì)胞，計(jì)數(shù)并計(jì)算酵母死亡率。酵母死亡率計(jì)算公式如下
2）將收集的發(fā)酵液離心收集菌體，2.5%的戊二醛固定后，用掃描電鏡（SEM）進(jìn)行細(xì)胞顯微學(xué)在6 000 的倍數(shù)下觀察細(xì)胞形太。
3）發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定發(fā)酵液酒精度。
2 結(jié)果與分析
2.1 FKS1、FKS2 和FKS3 基因缺失型菌株的構(gòu)建
將該基因中斷盒轉(zhuǎn)化入原始菌株W303，通過(guò)同源重組法用KanMX 替換FKS1 基因，從而敲除FKS1 基因。將得到的轉(zhuǎn)化子提取基因組，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖2 所示，圖2（a）設(shè)計(jì)引物是FKS1 基因上游同源臂和KanMX 之間的序列，擴(kuò)增的是陽(yáng)性結(jié)果為1 213 bp；圖2（b）設(shè)計(jì)引物是擴(kuò)增FKS1基因上下游同源臂之間的序列。重組菌PCR 結(jié)果為2 100 bp，原始菌株結(jié)果為5 844 bp，不添加模板結(jié)果為空白，驗(yàn)證結(jié)果符合理論值，構(gòu)建的重組菌命名為fks1-QT。
圖2 P CR 驗(yàn)證重組菌中fks1-QT 中FKS1 基因敲除Fig.2 PCR verification of the FKS1 knocked-out in fks1-QT strain
同樣的分子操作構(gòu)建FKS2 和FKS3 缺陷型菌株。FKS2 和FKS3 缺陷菌株的基因組分別DNA 用F2-UF/F2-UR、F2-DF/F2-DR 和F3-UF/F3-UR、F3-DF/F3-DR 引物對(duì)進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，結(jié)果如圖3和圖4 所示，驗(yàn)證結(jié)果符合理論值，將重組菌株命名為fks2-QT 和fks3-QT。
圖3 P CR 驗(yàn)證重組菌中fks2-QT 中FKS2 基因敲除Fig.3 PCR verification of the FKS2 knocked-out in fks2-QT strain
圖4 P CR 驗(yàn)證重組菌中fks3-QT 中FKS3 基因敲除Fig.4 PCR verification of the FKS3 knocked-out in fks3-QT strain
2.2 重組菌生長(zhǎng)性能分析
酵母的生長(zhǎng)活性對(duì)酵母的工業(yè)應(yīng)用有重要作用，圖5 所示為各重組菌株與原始菌的生長(zhǎng)曲線，由圖5 可知，重組菌株fks2-QT 和fks3-QT 的生長(zhǎng)速度和原始菌株W303 差異不大，而重組菌種fks1-QT 的生長(zhǎng)速度始終慢于原始菌株。FKS1 基因是合成細(xì)胞壁葡聚糖酶的關(guān)鍵基因，敲除FKS1 基因的菌株合成酵母細(xì)胞壁葡聚糖的能力減弱，酵母細(xì)胞壁的正常代謝功能受到影響，從而影響酵母的生長(zhǎng)。FKS2 基因?qū)铣杉?xì)胞壁葡聚糖有一定影響較小，F(xiàn)KS2 基因的缺失并沒(méi)有影響酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)。FKS3 對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)并無(wú)太大影響。因此，F(xiàn)KS1基因?qū)S持酵母細(xì)胞活性有一定作用，F(xiàn)KS1 基因的缺陷導(dǎo)致細(xì)胞的生長(zhǎng)速度減緩，F(xiàn)KS2、FKS3 基因?qū)湍傅纳L(zhǎng)率沒(méi)有明顯的影響作用。
圖5 重組菌株和原始菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.5 Growth curves of the recombination strains and wild type strain
2.3 不同菌株細(xì)胞壁多糖含量的分析
重組菌株和原始菌株酵母細(xì)胞壁多糖的含量如圖6 所示，重組菌株fks1-QT（1.77±0.11）mg/g，3-β-葡聚糖的含量相對(duì)于原始菌株W303（3.44±0.097）mg/g 降低了約60%。重組菌 株fks2-QT（2.76±0.13）mg/g 和fks3-QT（3.10±0.15）mg/g 的1，3-β-葡聚糖的含量相對(duì)于原始菌株W303 分別降低了19.5%和3.8%，變化程度不大。FKS1 基因的缺失導(dǎo)致酵母菌株細(xì)胞壁1，3-β-葡聚糖的含量大幅度降低。FKS2 基因缺失導(dǎo)致酵母菌株細(xì)胞壁1，3-β-葡聚糖的含量明顯降低，F(xiàn)KS2 基因?qū)图?xì)胞壁葡聚有影響但作用不大。FKS3 基因缺失對(duì)酵母菌株細(xì)胞壁1，3-β-葡聚糖的含量并無(wú)太大影響。
重組菌株fks1-QT 細(xì)胞壁中甘露聚糖的含量為（3.42±0.10）mg/g，相對(duì)于原始菌株W303（2.81±0.09）mg/g 增加了17.8%，重組菌株fks2-QT 和fks3-QT 細(xì)胞壁甘露聚糖的含量相對(duì)W303 有一定程度減少。重組菌株fks1-QT（0.28±0.04）mg/g 細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)相對(duì)于原始菌株W303（0.12±0.03）mg/g增加了57.1%，重組菌株fks2-QT 和fks3-QT 細(xì)胞壁幾丁質(zhì)的含量相對(duì)W303 沒(méi)有太大變化。突變菌株細(xì)胞壁中1，3-β-葡聚糖的含量都有不同程度的降低，酵母細(xì)胞壁成分是動(dòng)態(tài)的，為了維持細(xì)胞壁完整性，其他多糖會(huì)隨之產(chǎn)生變化。
圖6 細(xì)胞壁多糖含量Fig.6 Content of polysaccharides in cell wall
2.4 抗環(huán)境脅迫能力分析
酵母菌株在工業(yè)應(yīng)用中要面對(duì)發(fā)酵液中環(huán)境的壓力，是反映酵母性能的重要指標(biāo)。原始菌株和重組菌株對(duì)滲透壓、酒精濃度以及對(duì)饑餓的抗性如圖7 所示：在含有0.5 NaCl mg/g 及饑餓培養(yǎng)條件下，原始菌株W303 的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)最明顯，而重組菌株fks1-QT 的生長(zhǎng)性能最差，而在在10%乙醇的環(huán)境壓力下，原始菌株W303 的抗性最差。酵母細(xì)胞壁有抵抗外界滲透壓的作用，細(xì)胞1，3-β-葡聚糖的含量減少，導(dǎo)致酵母細(xì)胞細(xì)胞壁抵抗外界滲透壓能力變?nèi)?，突變菌株在在含?.5 NaCl mg/g 的條件下生產(chǎn)性能較差。細(xì)胞壁1，3-β-葡聚糖的含量減少導(dǎo)致突變菌尤其是FKS1 基因缺失菌株對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力變?nèi)?，在饑餓培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)狀況較差。在10%乙醇環(huán)境壓力下，原始菌株的生長(zhǎng)狀況較差。該結(jié)論可以證明，F(xiàn)KS 家族基因?qū)?xì)胞抗?jié)B透壓和饑餓的能力有重要作用，而對(duì)抗酒精脅迫的能力有負(fù)面影響。
2.5 酵母液體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)
圖7 不同菌株在抗性平板上的生長(zhǎng)狀況Fig.7 Different strains growth condition in stressful environment
為判斷不同菌株在啤酒發(fā)酵條件下的狀況，將菌株置于麥汁培養(yǎng)基中發(fā)酵，模擬發(fā)酵環(huán)境。分別于第2、7 和12 天取發(fā)酵液，測(cè)定酵母死亡率，并掃描電鏡觀察酵母的形態(tài)（圖8）。如表4 所示，第2 天不同菌株的死亡率差異不大，酵母細(xì)胞的形態(tài)都是飽滿、圓潤(rùn)、沒(méi)有破損的，隨著時(shí)間的推移不同菌株酵母的死亡率差異越大。第12 天時(shí)，fks1-QT 菌株的死亡率最高，觀察SEM 圖片，細(xì)胞出現(xiàn)較大范圍的自溶狀況，細(xì)胞內(nèi)容物流出，嚴(yán)重干癟變形。fks2-QT 菌株的死亡率與原始菌株W303 接近，且與原始菌株W303 相同部分酵母開(kāi)始有破損，小范圍的酵母出現(xiàn)自溶狀況。重組菌株fks3-QT 的死亡率低，并且低于原始菌株W303 的死亡率，細(xì)胞依舊圓潤(rùn)，比較完整，良好的抵抗外界壓力。由此證明，F(xiàn)KS1 基因通過(guò)控制對(duì)細(xì)胞壁的完整性對(duì)抵抗發(fā)酵環(huán)境的壓力有重要的作用，F(xiàn)KS3 基因?qū)?xì)胞抵抗發(fā)酵環(huán)境的壓力作用有負(fù)面作用。
表4 細(xì)胞在發(fā)酵液中的死亡率Table 4 Mortality rate of yeast cells in the fermentation broth
圖8 原始菌株和重組菌株的掃描電鏡（SEM）分析Fig.8 SEM analysis of wild type strain and mutant strains
2.6 FKS 家族基因?qū)湍负铣梢掖寄芰Φ挠绊?/h3>
模式菌株W303 不具備工業(yè)酵母良好的發(fā)酵性能，但有完整的合成乙醇的途徑，測(cè)定重組菌株和原始菌株的酒精度，可反映FKS 家族基因?qū)湍讣?xì)胞合成乙醇的影響，對(duì)工業(yè)酵母有一定的指導(dǎo)意義。經(jīng)過(guò)15 d 的發(fā)酵后測(cè)定發(fā)酵液的酒精度（圖9），重組菌株fks3-QT（1.53±0.031）%的酒精度最高，之后依次為W303（1.23±0.032）%、fks2-QT（0.85±0.031）%、fks1-QT（0.485±0.031）%。根據(jù)2.5節(jié)的分析FKS 家族基因?qū)湍傅幕钚浴?duì)外界環(huán)境的耐壓性有不同的影響，抗發(fā)酵環(huán)境壓力強(qiáng)的菌株fks3-QT 活性更強(qiáng)導(dǎo)致發(fā)酵合成的乙醇濃度最高，抗發(fā)酵環(huán)境壓力較弱的菌株fks1-QT 活性更弱導(dǎo)致發(fā)酵合成的乙醇濃度最低。因此，F(xiàn)KS 家族基因通過(guò)影響酵母在發(fā)酵時(shí)的細(xì)胞狀態(tài)，從而影響酵母合成乙醇的能力。
圖9 不同菌株發(fā)酵酒精度Fig.9 Fermentation liquid alcohol of different strains
3 結(jié)語(yǔ)
酵母抵抗外界環(huán)境的壓力對(duì)酵母在發(fā)酵工業(yè)中，尤其是啤酒行業(yè)的生產(chǎn)起著關(guān)鍵的作用。了解酵母抗壓力機(jī)制，對(duì)選育強(qiáng)壯的酵母有重要的指導(dǎo)作用。酵母也常被用來(lái)作為模式生物研究真核細(xì)胞的遺傳學(xué)和生理學(xué)，但是多倍體酵母中，多位基因存在時(shí)在基因改良過(guò)程中有可能發(fā)生回復(fù)突變[23]，單倍體W303 模式菌株則可以避免這些問(wèn)題。
本研究運(yùn)用生物學(xué)手段得到FKS 家族基因單個(gè)敲除的重組菌株，比較原始菌株和重組菌種的生長(zhǎng)狀況、細(xì)胞壁多糖含量、抗脅迫能力以及在發(fā)酵環(huán)境下的死亡率等。發(fā)現(xiàn)重組菌株fks1-QT 細(xì)胞壁1，3-β-葡聚糖相對(duì)于原始菌株W303 的含量降低了60%，且生長(zhǎng)性能較差，但抗酒精脅迫抗性更強(qiáng)，而滲透壓和饑餓耐受性較差，在發(fā)酵環(huán)境中也更容易死亡。重組菌種fks2-QT 細(xì)胞壁中β-葡聚糖的含量略低于原始菌株W303，其他生理形狀與原始菌株相差不大。重組菌株fks3-QT 在發(fā)酵環(huán)境中的死亡率低于原始菌株，SEM 電鏡中fks3-QT 的狀態(tài)、酒精代謝活性也優(yōu)于原始菌株，因此FKS1 基因?qū)湍妇S持細(xì)胞耐受性、保證細(xì)胞正常生長(zhǎng)有重要的作用，而FKS3 基因?qū)湍改褪苄杂胸?fù)面作用，但其作用機(jī)理仍待研究。
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