吳燕敏 孫潔 王左鈺 陸培華 許雋穎 劉超英 吳兵

【摘要】目的?研究鈣蛋白酶-9（Calpain-9）蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達并探討其臨床意義。方法?應(yīng)用免疫組化方法和免疫印跡法檢測72例結(jié)腸癌患者的癌組織及癌旁組織中的Calpain-9和K-ras蛋白的表達情況，分析其與結(jié)腸癌臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果?Calpain-9在結(jié)腸癌組織中的陽性率較正常結(jié)腸黏膜組織顯著降低，而K-ras表達水平在結(jié)腸癌中顯著升高（P<0.05）。結(jié)腸癌組織中Calpain-9表達與結(jié)腸癌組織學(xué)分化類型、臨床分期以及遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05），且與遠處轉(zhuǎn)移、K-ras表達水平呈負相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論?Calpain-9在結(jié)腸癌中的異常表達提示其可能參與了結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。

【關(guān)鍵詞】結(jié)腸癌;腫瘤預(yù)后;鈣蛋白酶-9

中圖分類號：R735.35?文獻標(biāo)志碼：A?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.12.004

【Abstract】Objective?To study the expression of Calpain-9 protein in colon cancer and to explore its clinical significance.Methods?The expressions of Calpain-9 and K-ras protein in 72 cases of colon cancer patients and adjacent tissues were detected by immunohistochemistry and immunoblotting，and their correlation with clinicopathological parameters of colon cancer was analyzed.Results?The positive rate of Calpain-9 in colon cancer tissues was significantly lower than that in normal colonic mucosa tissues，while the expression level of K-ras was significantly increased in colon cancer（P<0.05）.The expression of Calpain-9 in colon cancer tissues was related to the histological differentiation type，clinical stage and metastasis of colon cancer （P<0.05）.Further analysis showed that the expression level of Calpain-9 in colon cancer tissues was negatively correlated with metastasis and K-ras expression levels（P<0.05）.Conclusion?Abnormal expression of Calpain-9 in colon cancer suggests that it may be involved in the development of colon cancer.

【Key words】colon cancer;neoplasm prognosis;Calpain-9

近年來，結(jié)腸癌的發(fā)病率及死亡率在全球范圍內(nèi)均居高不下，尤其是在亞洲，結(jié)腸癌是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的重要原因之一。雖然結(jié)腸癌的手術(shù)及輔助治療技術(shù)已取得長足進步，但結(jié)腸癌患者的預(yù)后仍然很差，5年生存率低于50%[1]。缺乏早期診斷意識和有效的預(yù)防措施是結(jié)腸癌的高發(fā)病率和死亡率的關(guān)鍵原因[2]。腫瘤的發(fā)生與編碼或非編碼基因結(jié)構(gòu)和表達異常有關(guān)[3]，由于腫瘤的個體差異性，患者在同一階段可能具有不同的治療結(jié)果[4]。因此，尋找結(jié)腸癌致病相關(guān)的新的分子標(biāo)志物及機制至關(guān)重要，將為結(jié)腸癌患者的治療提供新方向。鈣蛋白酶是一種半胱氨酸蛋白酶，具有鈣離子依賴性，在細胞骨架的重構(gòu)、細胞的分化、信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞的死亡等多種生命過程中起著舉足輕重的作用[5]。已有研究證實，鈣蛋白酶-9（Calpain-9）是消化系統(tǒng)的特異性鈣蛋白酶[6]，并且對胃腸道黏膜有著很好的保護作用[7]。然而，Calpain-9在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及與患者預(yù)后的相關(guān)性仍不清楚，本研究通過檢測結(jié)腸癌患者癌組織與其癌旁組織中Calpain-9的表達，并分析與臨床病理特征的相關(guān)性，探討Calpain-9在結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1?資料與方法

1.1?一般資料

選取2016年3月至2018年11月在無錫市某兩家三級甲等醫(yī)院普外科病理明確診斷為結(jié)腸癌并且已經(jīng)行根治性結(jié)腸癌手術(shù)或姑息性結(jié)腸癌切除術(shù)治療的72例患者作為研究對象，所有患者均取腫瘤組織及其配對的癌旁組織標(biāo)本（需距腫瘤組織邊緣≥5 cm，且病理明確沒有癌細胞）。本研究通過兩家醫(yī)院的倫理委員會批準(zhǔn)，并且在手術(shù)前獲得患者或患者家屬的簽字同意。所有患者手術(shù)前皆未接受過抗腫瘤治療（包括輔助放療、輔助化療和靶向治療等）。研究對象包含男性50例，女性22例，年齡39～78歲，平均（60.52±10.16）歲。研究對象依據(jù)美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（2010年）公布的結(jié)腸癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：包括臨床分期I期+Ⅱ期30例，Ⅲ期+Ⅳ期42例;無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N0）23例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性（N1～N3）49例;病理分級高分化腺癌、中分化腺癌、低分化腺癌和黏液腺癌分別為18、16、29、9例。

1.2?納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：目前對結(jié)腸癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)國內(nèi)外還未有統(tǒng)一的明確規(guī)定，本研究主要根據(jù)大便隱血試驗、腸鏡及病理學(xué)檢查、相關(guān)腫瘤指標(biāo)、影像學(xué)（消化道造影、CT、MRI等）以及其他相關(guān)檢查，若檢查結(jié)果之間存在相互矛盾，則以腸鏡病理結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①臨床病例資料或隨訪資料不完整;②患者于圍手術(shù)期已死亡;③患者為腫瘤復(fù)發(fā)或者并發(fā)其他惡性腫瘤;④患者有重要臟器（心、肝、脾、腎等）功能障礙。

1.3?實驗試劑

兔抗人Calpain-9和K-ras多克隆抗體皆采購于美國Abgent公司;免疫組織化學(xué)實驗和免疫印跡實驗的其他試劑皆采購于上海百信生物科技公司。

1.4?免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)腸癌及配對癌旁組織中Calpain-9陽性細胞面積

①選取患者的腫瘤組織和配對癌旁組織，大小約0.5 cm×0.5 cm;②常規(guī)方法固定、包埋、切片;③依次進行脫蠟、抗原修復(fù);④加入一抗（兔抗人Calpain-9或K-ras多克隆抗體） 0.05 mL （1∶300），37℃恒溫孵育1 h或4℃恒溫過夜;⑤加入二抗0.5 mL （辣根過氧化物酶標(biāo)記），室溫孵育20 min;⑥依次進行二氨基聯(lián)苯胺顯色、復(fù)染、脫水和封片。結(jié)果判讀：組織標(biāo)本陽性細胞判定標(biāo)準(zhǔn)為細胞胞漿染色呈現(xiàn)棕色者。每張切片均選取5個高倍鏡（400×）視野，并進行定量灰度掃描（Leica RX250型圖像分析系統(tǒng)）以及采用Qwin軟件進行相關(guān)分析，最后自動計算出Calpain-9陽性細胞的面積。

1.5?免疫印跡法檢測結(jié)腸癌及配對癌旁組織中Calpain-9的表達水平

①分別選取患者的腫瘤組織和配對的癌旁組織，重約50 mg;②常規(guī)方法提取組織總蛋白;③采用BCA法測定樣本組織中的蛋白濃度;④采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白，依次通過濕法轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉后，加入兔抗人Calpain-9或K-ras多克隆抗體50 μL（1∶400），4℃恒溫過夜;⑤加入羊抗兔Ig-HRP 50 μL（1∶500），在室溫下孵育2 h后，采用ECL顯色，并以β-actin為內(nèi)參。

1.6?統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)經(jīng)雙人錄入SPSS 20.0統(tǒng)計軟件包，計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，變量之間的相關(guān)性，采用Spearman相關(guān)分析，檢驗水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2?結(jié)?果

2.1?結(jié)腸癌及其配對癌旁組織中Calpain-9陽性細胞的面積

與癌旁組織（6.96±0.72） 萬 μm2相比較，結(jié)腸癌組織（2.11±0.22） 萬 μm2中Calpain-9陽性細胞面積明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （t=54.663，P<0.001）。見圖1、圖2。

2.2?結(jié)腸癌及其配對癌旁組織中K-ras陽性細胞面積

與癌旁組織（2.26±0.19） 萬 μm2相比較，結(jié)腸癌組織（9.01±0.87） 萬 μm2中K-ras陽性細胞面積明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=64.318，P<0.001）。見圖3、圖4。

2.3?結(jié)腸癌及其配對癌旁組織中Calpain-9的表達水平

與配對癌旁組織即相對灰度值（0.34±0.06）相比，結(jié)腸癌細胞中Calpain-9 相對灰度值（0.12±0.04） 的表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=25.887，P<0.001）。見圖5。

2.4?結(jié)腸癌及其配對癌旁組織中K-ras的表達水平

與配對癌旁組織即相對灰度值（0.11±0.03）相比，結(jié)腸癌細胞中K-ras的相對灰度值（0.31±0.05）表達水平明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=29.104，P<0.001）。見圖6。

2.5?Calpain-9的表達與結(jié)腸癌臨床病理特征的相關(guān)性

Calpain-9表達與結(jié)腸癌組織學(xué)分化類型、臨床分期以及遠處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P<0.05）;而與結(jié)腸癌患者的性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性（P>0.05）。見表1。

2.6?結(jié)腸癌組織中Calpain-9表達與K-ras、臨床病理特征的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中Calpain-9的表達水平與遠處轉(zhuǎn)移、K-ras表達水平呈負相關(guān)（r=-0.383，P<0.05;r=-0.507，P<0.05），見圖7、圖8。而與臨床分期、分化類型無關(guān)（r=0.169，P>0.05;r=0.180，P>0.05）。

3?討?論

與其他惡性腫瘤相比，結(jié)腸癌具有高異質(zhì)性、死亡率高、預(yù)后差等特點。結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展涉及多種病理因素誘發(fā)，多種基因參與，多種病理過程產(chǎn)生（包括基因突變、原癌基因激活和抑癌基因失活）等，是一種漸進式積聚、由量變到質(zhì)變的繁瑣過程，而腫瘤相關(guān)標(biāo)志物對惡性腫瘤的分類、治療方案的制訂和預(yù)后評估有著重要作用[8]。Ras基因是目前公認的常見原癌基因之一，其包括H-ras基因、K-ras基因以及N-ras基因三種，其中K-ras基因最容易發(fā)生基因突變[9]，并有相當(dāng)多的研究表明K-ras突變是結(jié)腸癌致病及遠處轉(zhuǎn)移的重要病因[10]。

本研究應(yīng)用免疫組化法對72例結(jié)腸癌患者癌組織和配對癌旁正常組織黏膜中Calpain-9、K-ras表達水平進行了測定，結(jié)果顯示與癌旁正常組織相比，結(jié)腸癌組織中Calpain-9的表達水平明顯降低，此結(jié)果與田文武等的研究結(jié)果一致[11];而K-ras 的表達水平顯著升高，并且經(jīng)Spearman相關(guān)分析結(jié)果提示，Calpain-9表達水平與K-ras表達水平呈負相關(guān)。Taniguchi 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，K-Ras基因的激活直接參與了結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展，且對結(jié)腸癌預(yù)后的判斷有著重要作用[13]。早有相關(guān)報道稱，Calpain的蛋白酶小亞基1可以和RasGAP-SH3結(jié)合以形成capn4/RasGAP-SH3，而后者在Ras基因致癌信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著不可或缺的作用[14]。由以上結(jié)果推測，Calpain-9在細胞內(nèi)表達的減少引起capn4/RasGAP-SH3下降，進而致使K-ras依賴的MAPK致癌信號通路的啟動，有可能為結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制之一。

本研究亦對Calpain-9在結(jié)腸癌患者中的表達是否與性別、年齡、腫瘤直徑大小、不同臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類別分級以及有無遠處轉(zhuǎn)移等有關(guān)因素進行了探討，以期進一步闡明Calpain-9的表達水平與結(jié)腸癌不同病理特點間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，Calpain-9的表達水平雖與結(jié)腸癌患者的性別、年齡、腫瘤直徑大小和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間不存在統(tǒng)計學(xué)差異，但與結(jié)腸癌的病理類別分級、不同臨床分期、有無遠處轉(zhuǎn)移存在統(tǒng)計學(xué)差異;進一步進行Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織中Calpain-9的表達水平和遠處轉(zhuǎn)移、K-ras表達水平呈負相關(guān)。由此推測，Calpain-9可能是一種潛在的評估結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物。本研究納入研究的患者臨床資料完整，可信度較高，但亦存在樣本量有限等不足之處，有待于增加樣本量及相關(guān)動物實驗進一步驗證。

綜上所述，Calpain-9可能參與了結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展和腫瘤遷移過程，將有可能作為評判結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的新的腫瘤標(biāo)志物，為結(jié)腸癌的臨床治療提供新的思路。

參?考?文?獻

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（收稿日期：2019-10-24?修回日期：2019-11-18）

（編輯：梁明佩）