昆蟲病原線蟲與Bt聯(lián)用對黏蟲的防治效果

李而濤 曹雅忠 張帥 李克斌 李金橋 李曉峰 張海茹 尹姣

摘要 ：為明確昆蟲病原線蟲與Bt聯(lián)用后對黏蟲致病力的協(xié)同增效作用，本研究分別測定了自主分離獲得的一種新嗜菌異小桿屬線蟲Heterorhabditis sp.（LF）和實驗室保存的Heterorhabditis bacteriophora（Hb）線蟲對黏蟲的致病力;比較了兩種Bt菌株（HD1和G03）對黏蟲的毒力差異，開展了G03對黏蟲的毒力測定試驗;明確了室內(nèi)和田間試驗條件下兩種線蟲（LF和Hb）與G03聯(lián)用對黏蟲的交互作用。結(jié)果表明，黏蟲的死亡率隨兩種線蟲劑量的增加而增加，在100 IJs/mL劑量下黏蟲死亡率均達到了90%以上;Bt菌株G03對黏蟲的毒力顯著高于HD1，G03對黏蟲的LC50為3.55×1010 cfu/mL;室內(nèi)條件下LF 25 IJs/mL+G03（LC50）聯(lián)用處理6 d對黏蟲的防治具有顯著的協(xié)同增效作用，較單獨LF線蟲和G03處理死亡率分別提高了50.72和50.0百分點，Hb 25 IJs/mL+G03（LC50）聯(lián)用處理6 d對黏蟲的防治也具有顯著的協(xié)同增效作用，較單獨Hb線蟲和G03處理死亡率分別提高了76.67和50.0百分點;田間小區(qū)試驗表明線蟲與Bt聯(lián)用對黏蟲的防治具有協(xié)同的加成或增效作用，其中LF線蟲與G03聯(lián)用具有顯著的增效作用，較單獨LF線蟲和Bt處理死亡率分別提高了47.96和46.80百分點。本研究為黏蟲的防治提供了新的技術(shù)措施，拓寬了黏蟲生防研究的思路。

關(guān)鍵詞 ：昆蟲病原線蟲;?Bt;?黏蟲;?協(xié)同增效

中圖分類號：

S 433.4; S 476

文獻標(biāo)識碼：?B

DOI：?10.16688/j.zwbh.2018493

Control efficacy of the combined application of the entomopathogenic nematode

and Bt against the oriental armyworm，Mythimna separata （Walker）

LI Ertao1，?CAO Yazhong1，?ZHANG Shuai1，?LI Kebin1，?LI Jinqiao1，?LI Xiaofeng1，?ZHANG Hairu2，?YIN Jiao1

（1. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection， Chinese Academy

of Agricultural Sciences， Beijing?100193， China; 2. Bureau of Agriculture and Animal Husbandry of Kuancheng

Manzu Autonomous County， Chengde City， Hebei Province， Chengde?067600， China）

Abstract

In this study， we examined possible synergistic effects resulted from a combined application of the entomopathogenic nematode and Bt based on their virulence against Mythimna separata. The virulence of a newly isolated nematode Heterorhabditis sp. （LF） and a laboratory?maintained nematode Heterorhabditis bacteriophora （Hb） against Mythimna separata was determined and the virulence of two Bt strains （HD1 and G03） against M.separata was compared. The interactive effect of two nematodes （LF and Hb） and G03 on M.separata was determined under both laboratory and field conditions. The results showed that the mortality of M.separata increased with the dose of two nematodes. The mortality of M.separata reached more than 90% when 100 IJs/mL was applied. The LC50 value of of Bt strain G03 was 3.55×1010 cfu/mL，significantly higher than that of HD1. Compared to single application of nematode or Bt， combined application exhibited a significant synergistic effect. The mortality of M.separata increased by 50.72% and 50.0% when LF 25 IJs/mL+G03 （LC50） was applied for 6 days under indoor conditions， respectively. The application of Hb 25 IJs/mL+G03 （LC50） exhibited a significant synergistic effect of 76.67% and 50.0% under indoor conditions after 6 days compared to the controls （Hb or G03 applied alone）， respectively. Field trials showed that a combined application of nematodes and Bt had additive or synergistic effects on the mortality of M.separata. The combination of LF nematode and G03 showed a significant synergistic effect of 47.96% and 46.80%， respectively， higher than nematodes and Bt when applied alone. This study not only provides a new technical measure for the prevention and control of M.separata but also expands the research scope of biological control of M.separata.

1.2.2?Bt菌株HD1和G03對黏蟲的毒力比較

在玻璃培養(yǎng)皿中（d =13 cm）加入50 g左右的滅菌土（濕度18%左右、過40目篩），鋪平。將培養(yǎng)好的Bt菌株HD1和G03用無菌水稀釋為1.5×1012cfu/mL，將新鮮玉米葉片在菌懸液中浸漬約1 min，拿出后自然晾干，取適量放入培養(yǎng)皿中，每皿分別接入20頭健康、個體均勻的3齡黏蟲幼蟲。每個處理設(shè)3個重復(fù)，同時以浸漬無菌水作為對照。各處理置于人工氣候箱中正常飼養(yǎng)。根據(jù)需要及時添加浸漬菌液后并晾干的玉米葉，每隔24 h觀察并記錄黏蟲死亡情況。

1.2.3?Bt菌株G03對黏蟲的毒力測定

毒力測定方法同1.2.2，其中將培養(yǎng)好的Bt菌株G03用無菌水稀釋成1.0×1010、0.5×1011、1.0×1011、0.5×1012、1.0×1012cfu/mL 5個濃度梯度，每隔24 h統(tǒng)計黏蟲死亡情況并計算LC50。

1.2.4?昆蟲病原線蟲LF和Hb分別與Bt聯(lián)用對黏蟲致病力的交互作用

將線蟲LF和Hb的侵染期幼蟲分別用無菌水稀釋成25 IJs/mL和50 IJs/mL兩個濃度梯度，Bt菌株G03濃度設(shè)為LC50（3.55×1010cfu/mL），將不同濃度的LF、Hb線蟲與G03菌株兩兩組合后分別測定其對黏蟲的致病力，各組合分別為A：LF 25 IJs/mL+G03（LC50）;B：LF 50 IJs/mL+G03（LC50）;C：Hb 25 IJs/mL+G03（LC50）;D：Hb 50 IJs/mL+G03（LC50）。各組合處理方法如下：在玻璃培養(yǎng)皿中（d =13 cm）加入50 g左右的滅菌土，鋪平。將新鮮玉米葉片在G03菌懸液中浸漬約1 min，拿出后自然晾干，取適量放入培養(yǎng)皿中，每皿分別接入20頭健康、個體均勻的3齡黏蟲幼蟲。待黏蟲取食經(jīng)G03菌懸液浸漬的玉米葉片48 h后[25]，取1 mL搖勻的線蟲懸浮液均勻滴到培養(yǎng)皿中，每個組合處理設(shè)3個重復(fù)，同時以喂食未處理玉米葉片為對照。各處理置于人工氣候箱中正常飼養(yǎng)。根據(jù)需要及時添加浸漬菌液后并晾干的玉米葉，每隔24 h觀察并記錄黏蟲死亡情況。

1.2.5?昆蟲病原線蟲與Bt聯(lián)用對黏蟲致病力交互作用的田間試驗

6月中旬播種玉米，生長至喇叭口期時，選擇天氣連續(xù)為陰天或多云時開展田間試驗。試驗田共分為18個小區(qū)，每小區(qū)面積為12 m2（3 m×4 m），并罩有高度為2 m的40目網(wǎng)紗。各小區(qū)之間間隔2 m。試驗共設(shè)6個處理，分別為單獨LF、Hb線蟲處理，單獨G03處理，LF與G03聯(lián)用、Hb與G03聯(lián)用處理，清水對照處理，每處理設(shè)3個重復(fù)。LF、Hb線蟲濃度為2.5×103IJs/m2，Bt菌株G03濃度為1.11×1016cfu/m2。傍晚接蟲，在每個小區(qū)的每株玉米的卷芯中放入3頭2齡黏蟲幼蟲，田間適應(yīng)2 d后，觀察并統(tǒng)計每株上幼蟲數(shù)并保證在噴施線蟲或Bt前每株上只有2頭3齡幼蟲。整個試驗均采用噴霧的方式將線蟲和Bt均勻噴施在每個小區(qū)的玉米葉片和地面上，對于聯(lián)用小區(qū)在Bt處理48 h后噴施線蟲（傍晚）。每隔24 h觀察并記錄黏蟲死亡情況。

1.3?數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果中黏蟲的死亡率均為校正死亡率（%）。百分?jǐn)?shù)值均經(jīng)反正弦轉(zhuǎn)換后在Excel 2003與SPSS 17.0統(tǒng)計軟件上完成分析。處理之間的差異采用方差分析，然后采用Duncan氏法測驗不同處理之間的差異顯著性，概率水平設(shè)P<0.05。毒力回歸方程及致死中濃度用probit模型分析。

校正死亡率=處理死亡率-對照死亡率1-對照死亡率×100%。

由χ2檢驗判斷線蟲與Bt聯(lián)合作用類型[2628]。各處理昆蟲的死亡率=死亡蟲數(shù)除以處理總蟲數(shù)，并且轉(zhuǎn)換為校正死亡率。線蟲與Bt聯(lián)用對參試?yán)ハx的期望致死數(shù)ME由期望致死率M =MN+MB（1-MN），乘以參試?yán)ハx總數(shù)計算而得，其中MN和MB分別為線蟲和Bt單獨處理時試蟲的校正死亡率。χ2=（MNB-ME）2 /ME，其中MNB為線蟲與Bt聯(lián)用時試蟲的實際校正死亡數(shù)，ME為線蟲與Bt聯(lián)用時試蟲的期望致死數(shù)。計算出的χ2值與χ2值表進行比較。當(dāng)χ2≥3.84（df=1和P =0.05）及MNB ME時，顯示兩種殺蟲因子聯(lián)用表現(xiàn)為增效作用（synergism，即兩種殺蟲因子聯(lián)用后的毒力明顯超過各因子毒力的總和）。

2?結(jié)果與分析

2.1?昆蟲病原線蟲LF與Hb對黏蟲的致病力

LF線蟲處理6 d后對黏蟲致病力結(jié)果如圖1所示：黏蟲的死亡率隨線蟲劑量的增加而增加，在100 IJs/mL和125 IJs/mL劑量下黏蟲死亡率均達到了95%以上，且兩者差異不顯著（P>0.05），但均顯著高于75 IJs/mL處理的死亡率（P<0.05）;75 IJs/mL與50 IJs/mL處理間差異不顯著（P>0.05），但均顯著高于25 IJs/mL的處理（P<0.05），25 IJs/mL劑量處理后黏蟲死亡率為49.28%。Hb線蟲對黏蟲致病力趨勢與LF線蟲類似（圖2），但75 IJs/mL與50 IJs/mL處理間黏蟲死亡率差異顯著（P<005），25 IJs/mL劑量下黏蟲死亡率僅為2333%?？梢?，LF線蟲對黏蟲致病力略高于Hb線蟲。

2.2?Bt菌株HD1和G03對黏蟲的毒力比較

兩種Bt菌株對黏蟲毒力結(jié)果如圖3所示：HD1菌株對黏蟲毒力較弱，處理5 d后黏蟲死亡率僅為10.0%，且以后不再增加;G03菌株對黏蟲毒力較強，4 d后達到100%;圖中可以明顯看出在處理2 d后的任何時間段G03對黏蟲的毒力均顯著高于HD1菌株（P<0.05），表明G03菌株具有更為廣闊的應(yīng)用前景。

2.3?Bt菌株G03對黏蟲的毒力測定

室內(nèi)測定不同濃度下G03對黏蟲的毒力，由動態(tài)圖（圖4）可知：整體上黏蟲死亡率隨Bt濃度和處理時間的增加而增加;4 d后死亡率增加趨勢減緩，5 d后基本上不再增加。用1.0×1010、0.5×1011、1.0×1011、0.5×1012、1.0×1012cfu/mL的Bt濃度處理6 d后，黏蟲死亡率分別達到了28.33%、50.00%、70.00%、96.67%和100.00%。由表1可知G03對黏蟲的致死中濃度LC50為3.55×1010cfu/mL，相關(guān)系數(shù)為0.956。

2.4?病原線蟲LF和Hb分別與Bt（G03）聯(lián)用后對黏蟲的致病作用

由表2可知，無論是病原線蟲LF還是Hb與Bt菌株G03聯(lián)用后都具有一定的協(xié)同作用。LF 25 IJs/mL與G03聯(lián)用（A）處理不同時間黏蟲的死亡率均顯著高于單獨線蟲處理（P<0.05），聯(lián)用處理6 d黏蟲的死亡率顯著高于LF線蟲或Bt單獨處理（P<005），分別提高了50.72和50.0百分點，表現(xiàn)為增效作用（ME=44.78，MNB=60，χ2=5.17）;LF 50 IJs/mL與G03聯(lián)用處理不同時間的防治效果好于線蟲或Bt單獨處理（P<0.05），均表現(xiàn)為加成作用。Hb 25 IJs/mL與G03聯(lián)用處理不同時間差異顯著（P<0.05），聯(lián)用處理下黏蟲的死亡率顯著高于單獨Bt處理（P<0.05），聯(lián)用處理6 d黏蟲的死亡率顯著大于Hb線蟲或Bt單獨處理（P<0.05），分別提高了76.67和50.0百分點，表現(xiàn)為增效作用（ME=37.00，MNB=60.0，χ2=1430）;Hb 50 IJs/mL與G03聯(lián)用處理不同時間的防治效果均好于單獨Bt處理（P<0.05），表現(xiàn)為加成作用。

2.5?病原線蟲LF和Hb分別與Bt（G03）聯(lián)用對黏蟲致病力的田間試驗

LF線蟲與G03聯(lián)用田間效果如圖5所示：線蟲與Bt聯(lián)用4 d表現(xiàn)為加成作用，較單獨的線蟲與Bt處理下黏蟲死亡率分別提高了43.29和45.23百分點，聯(lián)用6 d后表現(xiàn)為顯著的協(xié)同增效作用（ME=35.47，MNB=50.06，χ2=6.00>3.84），較單獨線蟲和Bt處理的死亡率分別提高了47.96和46.80百分點。

Hb線蟲與G03聯(lián)用對黏蟲的田間效果如圖6所示：線蟲與Bt聯(lián)用4 d較單獨線蟲和Bt處理的黏蟲死亡率分別提高了35.95和35.61百分點，聯(lián)用6 d較單獨線蟲和Bt處理死亡率分別提高了43.99和36.78百分點，均表現(xiàn)為加成作用。

田間試驗結(jié)果表明病原線蟲LF、Hb與Bt菌株G03聯(lián)用對黏蟲的控制具有協(xié)同增效或加成作用，可顯著提高對黏蟲的致病力，縮短防控所需時間，其中病原線蟲LF與G03聯(lián)用效果較佳。

3?討論

黏蟲是我國重要的暴發(fā)性害蟲，目前對其防控方法比較單一，以化學(xué)防治為主，存在破壞自然生境、黏蟲抗藥性增強等潛在風(fēng)險。而生物防治具有綠色、無污染、對人畜安全等優(yōu)點頗受關(guān)注。為此本研究從黏蟲的綠色防控角度出發(fā)，利用昆蟲病原線蟲和Bt兩種生防因子對黏蟲的致病力展開了研究，同時探討了兩者聯(lián)用的協(xié)同增效作用，以期達到防蟲、減藥、增收的目的。尤為重要的是，隨著轉(zhuǎn)Bt玉米的大面積種植和推廣，此研究結(jié)果可以為經(jīng)典的生物控制策略與轉(zhuǎn)基因Bt作物相結(jié)合的技術(shù)集成提供借鑒，開辟對重大害蟲協(xié)調(diào)管理的新途徑。

目前，我國利用昆蟲病原線蟲防治黏蟲的研究報道中多數(shù)防治效果不佳。例如施用DD-136線蟲（1 800 IJs/mL）對黏蟲僅有40%的防效[29]，田間應(yīng)用中華卵索線蟲Ovomermis sinensis（4 500 IJs/m2）防治黏蟲時其校正寄生率也僅為52%[30]。為充分利用我國線蟲資源，深入挖掘?qū)︷はx有效的生防線蟲，實驗室通過大蠟螟誘集獲得了一種對黏蟲較為有效的嗜菌異小桿屬線蟲LF，該線蟲在100 IJs/mL劑量下處理6 d黏蟲的死亡率達到了95%以上;另外一種嗜菌異小桿屬線蟲Hb在相同濃度下黏蟲的死亡率達到了90%以上;而趙奎軍等室內(nèi)應(yīng)用斯氏線蟲S.feltiae Beijing品系在800 IJs/mL劑量下處理6 d后黏蟲的死亡率僅為78.9%[12]，說明嗜菌異小桿屬的這兩種線蟲在黏蟲的控制上具有巨大的生防潛力。但相比于化學(xué)農(nóng)藥，其速效性較差。

蔣善軍等研究表明Bt對黏蟲也有較好的防治效果[31]。試驗中比較了兩種Bt菌株對黏蟲的毒力差異，結(jié)果顯示在相同劑量下G03處理后黏蟲死亡率高達100%，而HD1菌株僅有10%。該生測結(jié)果與姚萌等比較G03和HD1基因組分析結(jié)果相吻合，其研究結(jié)果顯示，G03菌株含有HD1不具有的Cry1Ca、Cry1Da基因，使其在蟲害控制方面更具優(yōu)勢;與HD1相比，G03含有較少的噬菌體、轉(zhuǎn)座子相關(guān)基因，G03可能有更好的遺傳穩(wěn)定性，使其在發(fā)酵中更穩(wěn)定[32]。盡管G03表現(xiàn)出了較為優(yōu)秀的殺蟲活性，但其需要較高的濃度（0.5×1012 cfu/mL及以上）才可高效殺死黏蟲，而較高的濃度將增加黏蟲產(chǎn)生抗性的風(fēng)險。已有研究表明長期使用高濃度Bt會使目標(biāo)害蟲產(chǎn)生抗藥性，如美國棉鈴蟲Helicoverpa armigera在田間對Bt棉產(chǎn)生了抗性，印度田間的紅鈴蟲Pectinophora gossypiella對Cyr1Ac產(chǎn)生了抗性等[3334]。而將兩種昆蟲病原線蟲分別與Bt菌株G03聯(lián)用后，室內(nèi)和田間結(jié)果均表明對黏蟲具有顯著的加成或增效作用。在田間試驗中，LF線蟲與G03聯(lián)用后較單獨線蟲和Bt處理黏蟲的死亡率分別提高了47.96和46.80百分點。因此，線蟲和Bt聯(lián)用一方面可以減少線蟲和Bt的使用劑量、提高速效性、節(jié)約防治成本，另一方面可以降低黏蟲對線蟲或Bt產(chǎn)生抗性的風(fēng)險。

應(yīng)用Bt預(yù)處理后，Bt菌株產(chǎn)生的毒素可能會引起黏蟲中腸組織病變導(dǎo)致其中腸腸壁細(xì)胞排列疏松，細(xì)胞明顯出現(xiàn)空洞化[35]，這不僅便于病原線蟲侵入，同時導(dǎo)致黏蟲自身免疫力降低，對線蟲的抵御能力下降，有利于其共生菌在黏蟲體內(nèi)繁殖;線蟲會對寄主體內(nèi)的CO2濃度、分泌物等做出敏感反應(yīng)[36]，而經(jīng)Bt處理后勢必會引起寄主體內(nèi)代謝活動的變化[37]，間接提高了線蟲的侵入幾率，以上因素都可能是兩者聯(lián)用產(chǎn)生加成或增效效果的原因。

本試驗在田間進行期間，氣候條件比較適宜線蟲的存活和侵染。實際應(yīng)用時建議與一些線蟲保濕劑配合使用，盡量避開晴天或多雨天氣。本研究只是初步明確了線蟲與Bt聯(lián)用對黏蟲的防控具有協(xié)同作用，后續(xù)試驗還需要評估Bt菌株是否會對線蟲受精卵、各齡期幼蟲的活力存在副作用，取食Bt后的黏蟲對線蟲寄生情況的影響以及線蟲和Bt施用后持效期的長短等;另外還需從組織病理學(xué)及體內(nèi)相關(guān)酶活性變化的角度對聯(lián)用機理展開深入研究，為推動此防治策略在黏蟲上的推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）