楊蕾 楊海健 李勛蘭 楊波華 洪林 張云貴

摘要 ：本文利用Illumina Miseq高通量測序技術對重慶地區(qū)有青苔病癥和無病癥的柑橘葉際真核生物的群落組成、結構、多樣性及差異進行了研究，旨在找到可能的病原物類群，為更好地防治柑橘青苔病奠定基礎。結果表明13個柑橘葉片樣本共檢測到303個OTU，多樣性較為豐富;優(yōu)勢門為鏈形植物門Streptophyta、子囊菌門Ascomycota、綠藻門Chlorophyta等;通過分析發(fā)現(xiàn)可能的病原物為不可培養(yǎng)的虛幻球藻屬球藻uncultured Apatococcus sp.、黃綠異小球藻Heterochlorella luteoviridis、無柄杯梗孢Cyphellophora sessilis、海南橡膠藻Heveochlorella hainangensis、Coniochaetales sp. GMG C4、橢圓球藻Chloroidium ellipsoideum、Kalinella bambusicola等;不同區(qū)縣表現(xiàn)出青苔病癥狀的柑橘葉片上疑似病原物的種類和豐度都差異很大。柑橘青苔病可能是由多種藻類及真菌復合侵染造成的，病原物和柑橘葉片間的相互作用有待進一步研究。

關鍵詞 ：柑橘;?青苔病;?高通量測序;?病原;?多樣性

中圖分類號：

S436.66

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2018434

Influence of moss disease on the biodiversity of phyllosphere

microbe on citrus leaves

YANG Lei1，?YANG Haijian1，?LI Xunlan1，?YANG Bohua2，?HONG Lin1，?ZHANG Yungui1

（1. Fruit Research Institute of Chongqing Academy of Agricultural Sciences， Chongqing?401329， China;

2. Maize Research Institute of Chongqing Academy of Agricultural Sciences， Chongqing?401329， China）

Abstract

The eukaryotic diversity of citrus phyllosphere microbe communities after moss infection in Chongqing was analyzed to find the possible pathogens， and to lay the foundation for better controlling citrus moss disease. In this paper， Illumina Miseq high?throughput sequencing technology was used to explore the differences of eukaryotic composition and structure community between having symptoms samples and no symptoms samples in Chongqing. 303 OTU were detected from 13 citrus leaves samples， and the diversity of samples was abundant. The results showed that the advantage phylum were Streptophyta， Ascomycota， and Chlorophyta. The advantage classes were Dothideomycetes， Trebouxiophyceae， Eurotiomycetes， Sordariomycetes. The possible pathogens were uncultured Apatococcus sp.， Heterochlorella luteoviridis， Cyphellophora sessilis， Heveochlorella hainangensis， Coniochaetales sp. GMG C4， Chloroidium ellipsoideum and Kalinella bambusicola etc. The species and abundance of suspected pathogens varied widely. The occurrence of citrus moss disease may be caused by a variety of algae and fungal complex infection， the interaction between pathogen and citrus leaves remains to be further studied.

Key words

citrus; moss disease;?high?throughput sequencing;?pathogen;?diversity

1981年 Blakeman 首次將寄生在植物葉片表面的微生物定義為葉際微生物[12]。由于葉、莖、花、果等植物地上部分的環(huán)境條件一致，人們普遍認為葉際是指維管植物地上部分的表面和內(nèi)部。地球上植物的葉面面積大概為十億平方公里[3]，與根際環(huán)境相比，葉際環(huán)境的營養(yǎng)物質和水資源相對匱乏，且面臨著紫外線照射、溫差過大和存在活性氧等不利于微生物生長的嚴苛條件。即便如此，葉際微生物的組成仍然十分豐富且復雜，不同物種有著不同的微生物群落[45]，包括細菌、真菌和原生生物等。葉際微生物在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中也扮演著重要角色，葉際微生物之間的互作可以影響植株的健康與生長，以及農(nóng)作物的產(chǎn)量[67]。然而，農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中關于非病原微生物的定殖和病原微生物的相互作用以及單個菌株對微生物群落影響等方面的研究較少。目前，在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中很少有運用高通量測序技術研究作物葉際微生物病原菌相互作用的報道。

重慶地區(qū)高溫多雨、溫暖濕潤，有利于柑橘生長的同時也有利于病害的發(fā)生;另一方面，柑橘屬于常綠樹種，通常長勢較旺，枝葉繁茂，郁閉度較高，這也為柑橘病害的發(fā)生提供了良好的條件。其中柑橘青苔病就是一種受潮濕多雨氣候影響甚重的病害。在我國南方的多雨季節(jié)，在一些通風不良的柑橘果園，經(jīng)常能見到樹干、枝葉甚至地面上布滿青苔，嚴重阻礙樹體光合作用，進而影響果實外觀品質。目前國內(nèi)外學者對柑橘青苔病的研究報道很少，對其病因、病原特性及防治方法等尚未形成系統(tǒng)科學的研究體系。為了探尋不同區(qū)域條件下有青苔病癥和無病癥柑橘葉片葉際真核生物群落多樣性和群落結構的差異，分析可能的侵染柑橘的青苔病原種類，我們通過高通量測序的方法對重慶3個區(qū)縣柑橘葉片進行了葉際真核生物多樣性分析，以期確定柑橘青苔病的病原，并為柑橘青苔病的防治提供理論依據(jù)。

1?材料和方法

1.1?試驗材料和采樣地點

在重慶奉節(jié)、開州、忠縣3個區(qū)縣選擇管理水平相似、海拔水平相近的5個果園采集樣品。柑橘品種為‘W·默科特[8]。采樣方法為：在每個果園東南西北中5個方位各選擇1棵樣樹，在每棵樣樹上隨機挑選有青苔病癥和無青苔病癥的葉片各9片，即1份樣品45片柑橘葉片。共采集13份，樣品信息見表1。

1.2?真核生物基因組 DNA的提取及質量檢測

柑橘葉表的真核生物基因組DNA采用FastDNATM SPIN Kit for soil進行提取，用Nanodrop 2000檢測基因組 DNA質量。濃度≥10 ng/μL，總量≥500 ng，純度OD260/280=1.7～2.0的DNA可用于后續(xù)試驗。取3 μL DNA用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA完整性。檢測電壓為120 V，電泳時間約為20 min。

1.3?高通量測序及數(shù)據(jù)分析

1.3.1?真核生物 DNA的提取和擴增

以3個不同區(qū)縣采集的13份柑橘葉片DNA原液作為PCR模板，對其18S rRNA V4 區(qū)進行高保真PCR擴增，設置3個重復試驗，同時以標準的真菌/真菌基因組DNA Mix作為陽性對照。擴增引物根據(jù)選定的檢測區(qū)域確定，Primer F=Illumina adapter sequence1+TTGGYRAATGCTTTCGC，Primer R=Illumina adapter sequence 2+CGCGGTAATTCCAGCTCCA。PCR擴增程序為：94℃預變性2 min;94℃變性20 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，25個循環(huán);最后在72℃下延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物是否單一和特異。將同一個樣本的3個平行擴增產(chǎn)物混合，每個樣品加入等體積的Agencourt AMPure XP核酸純化磁珠進行純化。委托上海天昊生物科技有限公司進行 Illumina MiSeq[9]高通量測序。

1.3.2?DNA文庫的建立及上機測序

利用帶有Index序列的引物，通過高保真PCR向文庫末端引入特異性標簽序列。反應采用8個循環(huán)的PCR程序。擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，應用核酸純化磁珠對擴增產(chǎn)物進行純化，得到一個樣本的原始文庫。

根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳的初步定量結果，對已經(jīng)帶有各自Index標簽的樣本文庫濃度進行適當稀釋，再利用Qubit對文庫進行精確定量，根據(jù)不同樣品的測序通量要求，按相應比例（摩爾比）混合樣品。對于混樣后的文庫采用Agilent 2100 Bioanalyzer檢驗測序文庫插入片段的大小，確認在120～200 bp之間無非特異性擴增，并準確測定測序文庫濃度。采用Miseq平臺2×250 bp的雙端測序策略對文庫進行測序，最后對測序結果進行生物信息學分析。

1.3.3?OTU 聚類分析及注釋

運用USEARCH軟件合并序列長度和堿基組成完全一致的序列即重復序列，并去除singleton序列（只出現(xiàn)一次的序列），提取非重復序列以備后續(xù)分析。根據(jù)重復序列條數(shù)進行排序，使用UPARSE聚類方法將經(jīng)過質控后的序列按序列間97%的相似性歸并到一個操作分類單元（operational taxonomic units， OTU）。OTU是在系統(tǒng)發(fā)生學研究或群體遺傳學研究中為便于分析而人為設置的分類單元標志，簡單地說，OTU類似于種，是根據(jù)高變區(qū)序列比對得出的，一般相似度大于97%或95%的序列稱為同一個OTU[10]。OTU聚類的同時去除Chimera序列，以備后續(xù)OTU分類注釋。由于每個樣本對應的reads數(shù)量差距較大，為避免因樣品數(shù)據(jù)大小不同而造成分析時的偏差，在樣品達到足夠測序深度的情況下，需對每個樣品進行隨機抽平處理，獲得統(tǒng)一的基數(shù)（一般選擇測序樣本中最小測序reads數(shù)為基數(shù)），從而準確預測OTU的豐度。使用Mothur[11]軟件的classify.seqs命令，與SILVA數(shù)據(jù)庫進行比對，找出與OTU序列相似度最高且可信度達80%以上的物種信息用于OTU的注釋。

1.3.4?多樣性及群落結構分析

根據(jù)OTU列表中的供試樣品物種豐度，應用軟件Mothur中的summary.single命令，計算種群豐富度指數(shù)Chao 1指數(shù)[12]和ACE指數(shù)[13]，計算群落多樣性指數(shù)Shannon指數(shù)[14]、Simpson指數(shù)[15]、InvSimpson指數(shù)和用來評估樣本序列覆蓋度的Coverage指數(shù)[16]。

1.4?序列數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

首先使用FastQC評估原始數(shù)據(jù)的質量指標，通過FASTX?Toolkit對數(shù)據(jù)進行質量控制，剔除未識別堿基和低質量序列。然后使用Flash程序（version 1.0.0）進行拼接，通過引物barcode（標記），使用FASTX?Toolkit軟件進行混合樣品的分離。使用U?Chime （version USEARCH 5.2.32）去除嵌合序列。計算DNA矩陣，調用UPARSE程序，在97%的序列相似度水平下對序列進行OTU劃分。RDP?Classifer軟件分析的置信度參數(shù)設置為50%。用R語言vegan程序包完成多樣性分析。

所得數(shù)據(jù)用平均值和標準誤表示，采用IBM SPSS Statics 20軟件對所測數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，并應用Duncan氏新復極差法對不同處理間的差異顯著性進行檢驗，P值小于0.05被認為具有顯著差異。

2?結果與分析

2.1?柑橘葉際真核生物群落基本組成

13份柑橘葉片樣品經(jīng)處理后共獲得1 546 363條高質量序列片段，總堿基數(shù)為533 739 196個，平均長度為345.16 bp，共檢測到303個OTU。在生物多樣性和群落調查中，稀釋曲線（Rarefaction curve）被廣泛用于判斷樣品量是否充分，并用以估計物種豐富度。從圖1可以看出，13份樣品對應的稀釋曲線均基本趨于平緩，說明取樣基本合理，實際環(huán)境中真核生物群落結構的置信度較高，能夠比較真實地反映出樣品的群落組成情況。從物種注釋統(tǒng)計表（表2）可以看出，通過計算不同分類水平上的類型，樣品C2組鑒定到的真核生物類型最多，有133個門，118個綱和98個目，66個科，81個屬，70個種。雖然其他組的物種類型沒有C2組豐富，但均維持在豐富度較高的水平。

1） A1～A2： 奉節(jié)康樂鎮(zhèn)鐵福村有病癥組和無病癥組; B1?1～B1?2： 開州豐樂鎮(zhèn)黃陵村有病癥組; B2： 開州豐樂鎮(zhèn)黃陵村無病癥組; C1?1～ C1?2： 開州竹溪鎮(zhèn)白云村有病癥組; C2： 開州竹溪鎮(zhèn)白云村無病癥組; D1?1～D1?2： 開州竹溪鎮(zhèn)青吉村有病癥組; D2： 開州竹溪鎮(zhèn)青吉村無病癥組; E1～ E2： 忠縣新立鎮(zhèn)桂花村有病癥組和無病癥組。下同。

A1 and A2： Sample groups with and without symptoms from Tiefu village， Kangle town， Fengjie county; B1?1 and B1?2： Sample groups with symptoms from Huangling village， Fengle town， Kaizhou district; B2： Asymptomatic sample group from Huangling village， Fengle town， Kaizhou district; C1?1 and C1?2： Sample groups with symptoms from Baiyun village， Zhuxi town， Kaizhou district; C2： Asymptomatic sample group from Baiyun village， Zhuxi town， Kaizhou district; D1?1 and D1?2： Sample groups with symptoms from Qingji village， Zhuxi town， Kaizhou district; D2： Asymptomatic sample group of Qingji village， Zhuxi town， Kaizhou district; E1 and E2： Sample groups with and without symptoms from Guihua village， Xinli town， Zhongxian county. The same below.

2.2?柑橘葉際真核生物群落結構

通過柑橘葉際微生物樣本物種組成圖（圖2）可以看出不同分類水平上的優(yōu)勢物種。優(yōu)勢門：鏈形植物門Streptophyta、子囊菌門Ascomycota、綠藻門Chlorophyta和擔子菌門Basidiomycota;優(yōu)勢綱：座囊菌綱Dothideomycetes、共球藻綱Trebouxiophyceae、散囊菌綱Eurotiomycetes、子囊菌綱Sordariomycetes等;優(yōu)勢目：煤炱目Capnodiales、格孢菌目Pleosporales、刺盾炱目Chaetothyriales、小叢殼目Glomerellales、小球藻目Chlorellales等;優(yōu)勢科：Cladosporiaceae、Phaeosphaeriaceae、Trichomeriaceae、刺殼菌科Chaetothyriaceae、小叢殼科Glomerellaceae等;優(yōu)勢屬：枝孢屬Cladosporium、Parastagonospora、Knufia、彎梗孢屬Camptophora、異小球藻屬Heterochlorella等;優(yōu)勢種：多主枝孢Cladosporium herbarum、不可培養(yǎng)的虛幻球藻屬球藻uncultured Apatococcus sp.、Parastagonospora venae、Knufia petricola、Camptophora hylomeconis、黃綠異小球藻Heterochlorella luteoviridis、膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides等。

2.3?柑橘葉表真核生物多樣性分析

2.3.1?Alpha 多樣性分析

從表3可以看出，各處理組真菌的Coverage指數(shù)都超過了90%，說明在該水平上的測序結果能夠反映出所測樣本中生物的真實情況。Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)是常用的描述群落物種多樣性的Alpha多樣性指數(shù)，這些指數(shù)可以對群落物種組成的豐富度和均勻度進行綜合評價，而Shannon指數(shù)對物種豐富度更敏感。Chao1數(shù)值越高表明群落物種的豐富度越高，Shannon值越大說明群落多樣性越高，Simpson指數(shù)值越大群落多樣性越低[17]。從這些指數(shù)可以看出，柑橘葉片真核生物的多樣性較為豐富，其中Chao1指數(shù)最高和最低的分別是D1?1和A1，Shannon指數(shù)最高和最低的分別是C1?1和A2，Simpson指數(shù)最高和最低的分別是A2和C1?1。綜合這些指數(shù)的特征，在13組樣品中真核生物豐富度最高的是C1?1組。經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)，13組樣品間的真核生物豐富度及多樣性差異顯著（P<0.05），說明不同區(qū)域有病癥和無病癥柑橘葉表真核生物的豐富度都較高，且多樣性差異明顯。

2.3.2?Beta多樣性分析

Beta多樣性指標用來比較多組樣品之間的差異。根據(jù)不同的采樣地點將樣品分為了5組。Venn圖可以統(tǒng)計OTU水平中多組樣本中共有或獨有的物種數(shù)目，可以反映各個環(huán)境樣品在物種組成上的相似性及重疊情況[17]。共同含有的OTU數(shù)量越多說明樣品間的生物群落組成相似度越高。通過Venn圖（圖4）可以看出，不同區(qū)組柑橘葉表包含共有的真核生物OTU是85個，含有特異OTU個數(shù)最多的是E組。

2.3.3?主坐標分析

主坐標分析（principal coordinate analysis， PCoA），是一種基于距離評估數(shù)據(jù)相似性或差異性的可視化方法，通過對特征值和特征向量進行排序，選擇排在前幾位的特征值通過PCoA可以觀察個體或群體間的差異[18]。在PCoA圖中，空間較近的（距離較近的）樣本顯示樣本間的差異較少，反之，若樣本間距離較大則樣本間的差異性較大。將B1?1、B1?2合并為B1，C1?1、C1?2合并為C1，D1?1、D1?2合并為D1進行分析。從圖5可以看出，采集自奉節(jié)和忠縣的無病癥組A2和E2葉片的生物類型較為相似，距離近差異小;A1、B1、B2、C2、D1和E1的距離較近，樣品物種組成差異小;C1、D2與上述明顯聚在一起的兩大類的距離較遠，與它們的差異都較大。

2.4?有病癥組和無病癥組之間生物組成和結構的差異

2.4.1?有病癥組和無病癥組組成差異分析

將13份樣品分為有病癥組和無病癥組兩個組別。除柑橘和無記錄的物種外，選擇在種水平上相對豐度在前20位的物種繪制柱狀圖（圖6）。各樣品群落結構柱狀圖包含兩方面信息：樣本所含各分類水平物種和物種的相對豐度。

有病癥組中豐度是無病癥組的7倍以上的物種有：不可培養(yǎng)的虛幻球藻屬球藻uncultured Apatococcus sp.、黃綠異小球藻Heterochlorella luteoviridis、無柄杯梗孢Cyphellophora sessilis、海南橡膠藻Heveochlorella hainangensis、Coniochaetales sp. GMG C4、橢圓球藻Chloroidium ellipsoideum、Kalinella bambusicola;有病癥組中豐度是無病癥組的1～3倍物種有：膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides、Vishniacozyma carnescens、Jaminaea angkorensis。由此推測，柑橘青苔病可能的病原為以上10個物種中的一個或多個。在無病癥組中的豐度是有病癥組3倍以上的物種有：Camptophora hylomeconis、Farysia taiwaniana、Golubevia pallescens、Papiliotrema aurea，這些菌可能是潛在的生防菌株，或是在真核生物與柑橘寄主的互作關系中可發(fā)揮重要作用的菌株。

2.4.2?不同區(qū)域有病癥組病原物組成差異

不同區(qū)縣有青苔病癥狀的柑橘葉片上疑似病原物的種類和豐度都差異很大（圖7）。在奉節(jié)主要的病原為Jaminaea angkorensis和Coniochaetales sp. GMG C4，其中Jaminaea angkorensis所占比例高達91.76%，而黃綠異小球藻Heterochlorella luteoviridis、海南橡膠藻Heveochlorella hainangensis和Kalinella bambusicola這3種可能的病原菌并不包含在奉節(jié)采集的有病癥柑橘葉片中;與之形成鮮明對比的是采集自忠縣的有病癥葉片，其病原主要為海南橡膠藻H. hainangensis，其所占比例為35.50%，其次為K. bambusicola、橢圓球藻C. ellipsoideum和無柄杯梗孢C. sessilis，它們所占比例均在10%以上，而J. angkorensis和Coniochaetales sp. GMG C4所占比例均為0;采集自開州不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的有病癥柑橘葉片可能病原物的組成較為相似，主要為uncultured Apatococcus sp.、黃綠異小球藻H. luteoviridis和膠孢炭疽菌C. gloeosporioides這3種，但是這些優(yōu)勢種所占的比例有很大的不同。

3?討論

本研究應用高通量技術對采自重慶不同區(qū)縣有青苔病癥和無病癥的13份柑橘葉樣的真核生物物種進行了檢測。結果表明，鏈形植物門Streptophyta、子囊菌門Ascomycota、綠藻門Chlorophyta和擔子菌門Basidiomycota是13份樣品中真核生物的優(yōu)勢門。通過Alpha多樣性分析發(fā)現(xiàn)13份樣品中真核生物物種的多樣性差異不大。說明所選擇的采樣點雖然生境不同，但柑橘葉際真核生物的種類較為相似。對比分析有病癥組和無病癥組柑橘葉片生物種類和占比發(fā)現(xiàn)兩者之間的差異顯著，從有病癥組中的物種豐度顯著高于無病癥組的真核生物種類可以推測出可能的病原物為不可培養(yǎng)的球藻uncultured Apatococcus sp.、黃綠異小球藻Heterochlorella luteoviridis、無柄杯梗孢Cyphellophora sessilis、海南橡膠藻Heveochlorella hainangensis、Coniochaetales sp. GMG C4、橢圓球藻Chloroidium ellipsoideum、Kalinella bambusicola等。在無病癥組中的豐度顯著高于有病癥組的菌種可能是一些有重要功能的內(nèi)生菌或附生菌。內(nèi)共生菌能夠通過自身的代謝活動增強寄主植物對病蟲害的抗性[19]。

病害的發(fā)生流行除病原因素外還需具備適宜的環(huán)境條件[20]。通過對比不同區(qū)域有病癥組可能的病原物組成和占比發(fā)現(xiàn)，不同區(qū)域間的差異很大，由此可以推測不同區(qū)域內(nèi)引起柑橘青苔病的病原物不盡相同，這可能是不同區(qū)域光照、降雨量、相對濕度、溫度等氣候因子有較大差異造成的。顏學海、Kemp等學者研究表明病原菌多樣性與地理區(qū)域分布呈現(xiàn)一定相關性[2122]。這與本研究的結果較為一致。

本研究發(fā)現(xiàn)柑橘青苔病可能的病原物為不可培養(yǎng)的球藻uncultured Apatococcus sp.、黃綠異小球藻H.luteoviridis、無柄杯梗孢C.sessilis、海南橡膠藻H.hainangensis、Coniochaetales sp. GMG C4、橢圓球藻C.ellipsoideum、K.bambusicola、膠孢炭疽菌C.gloeosporioides等。王大平等研究認為柑橘青苔病是由綠藻門虛幻球藻屬虛幻球藻Apatococcus lobatus所致[23]，在其后期的研究中又發(fā)現(xiàn)該病病原是虛幻球藻和膠孢炭疽菌[24]。而本研究的結果與前人的結論有很大的不同。本研究結果表明柑橘青苔病的病原物大部分屬于藻類，其中含量最高的為uncultured Apatococcus sp.，但從高通量測序結果中并未發(fā)現(xiàn)虛幻球藻這種球藻。膠孢炭疽菌的相對豐富雖然較高，但與其他病原藻類相比存在的比例仍然較低。此外，膠孢炭疽菌作為柑橘炭疽病的病原菌在柑橘葉際較為普遍，本研究不可排除柑橘既感染柑橘炭疽病又滋生青苔的可能。因此，不能確定膠孢炭疽菌是柑橘青苔病的病原。

為了從柑橘品種相同、品種管理水平相似的果園中采取葉片樣本，本試驗選擇了重慶奉節(jié)、開州、忠縣3個區(qū)縣的‘W·默科特柑橘葉片，共采集樣品13份。由本次的試驗結果可以推測不同品種和不同區(qū)域內(nèi)柑橘葉際生物的種類都會有較大的差異，后續(xù)的研究中可以進行相關的探索。此外，健康及患病柑橘葉片間的相互作用有待進一步研究，對于處于不同病情等級下柑橘葉表的生物多樣性也值得探索。

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（責任編輯：楊明麗）