王芳芳，李鴻斌

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是與軟骨細(xì)胞凋亡相關(guān)的退行性疾病。至今尚無終止或逆轉(zhuǎn)該病的藥物。軟骨細(xì)胞的凋亡及自噬作用在OA病理機(jī)制中受到重視[1]。OA軟骨細(xì)胞凋亡機(jī)制及自噬對(duì)凋亡的影響機(jī)制，有可能成為治療和預(yù)防OA的有效方法。自噬是一種依賴溶酶體降解不必要的和功能失調(diào)的自身成分應(yīng)對(duì)損傷的適應(yīng)性反應(yīng)。自噬和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信號(hào)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響相互拮抗。mTOR受生長(zhǎng)因子、能量水平及其他信號(hào)的影響。本研究探討雷帕霉素(rapamycin, RAPA)-mTOR途徑誘導(dǎo)自噬抑制軟骨細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

收集2018年10月至2019年1月在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨科手術(shù)室實(shí)施全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的膝骨關(guān)節(jié)炎患者的OA軟骨標(biāo)本7例，OA符合1995年ACR修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，同時(shí)收集同期在同一醫(yī)院實(shí)施髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的股骨頸骨折患者的正常軟骨標(biāo)本5例。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)近期有膝關(guān)節(jié)感染史；(2)梅毒、乙肝等陽性；(3)繼發(fā)性O(shè)A；(4)6個(gè)月內(nèi)使用過干擾骨代謝的藥物，包括鮭魚降鈣素、雙磷酸鹽、特立帕肽、德尼單抗、雷洛昔芬和糖皮質(zhì)激素者。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

應(yīng)用二步酶消化法，從關(guān)節(jié)軟骨中分離軟骨細(xì)胞，并經(jīng)甲苯胺藍(lán)及Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色鑒定，體外傳代培養(yǎng)。應(yīng)用地塞米松(dexamethasone, DEX)誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡，然后用RAPA干預(yù)。依據(jù)軟骨細(xì)胞傳代培養(yǎng)的處理方案，將正常軟骨細(xì)胞和OA軟骨細(xì)胞分別分為3組：(1)BSA組(未處理，BSA濃度為100 μg/ml，培養(yǎng)12 h)；(2)DEX-BSA組(DEX劑量1×10-6mol/L，BSA濃度為100 μg/ml，培養(yǎng)12 h)；(3)RAPA+DEX-BSA組(RAPA至終濃度為1 mmol/L培養(yǎng)2 h，再加DEX-BSA至終濃度為100 μg/ml培養(yǎng)12 h)。噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)軟骨細(xì)胞活性；GFP-RFP-LC3腺病毒、Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測(cè)自噬流水平和自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin1和ULK1蛋白及基因表達(dá)。qRT-PCR和ELISA法檢測(cè)IL-1、TNF-α濃度。Annexin V-FITC/PI法及TUNEL法檢測(cè)凋亡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS 17.0軟件分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，2組間計(jì)量資料比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

共收集OA軟骨標(biāo)本7例，男3例，女4例，平均年齡為(67.7±5.8)歲；正常軟骨標(biāo)本5例，男3例，女2例，平均年齡為(67.6±8.0)歲。

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性

與BSA組正常和OA軟骨細(xì)胞活性(分別為100%±1.48%和98.25%±7.83%)比較，DEX-BSA組細(xì)胞活性(66.63%±2.17%和62.19%±1.92%)顯著下降(P<0.001)；與DEX-BSA組比，RAPA+DEX-BSA組細(xì)胞活性(88.94%±3.87%和85.42%±4.33%)顯著升高(P<0.001)。

2.3 LC3自噬雙標(biāo)腺病毒檢測(cè)自噬水平

mRFP-GFP-LC3腺病毒檢測(cè)自噬流情況(圖1)。各組自噬體熒光分光光度分析，OA軟骨細(xì)胞DEX-BSA組(0.017±0.002 4)比BSA組(0.033±0.004 9)顯著減少(P<0.01)，RAPA+DEX-BSA比DEX-BSA組正常(0.038±0.005 3vs. 0.025±0.003 3)和OA軟骨細(xì)胞(0.048±0.004 9vs. 0.017±0.002 4)顯著增加(P<0.05)。

2.4 Western blot測(cè)定LC3B、ULK1、Beclin1表達(dá)

以GAPDH作為內(nèi)參計(jì)算總LC3B的相對(duì)光密度=(LC3B-Ⅱ光密度+LC3B-I光密度)/GAPDH光密度。無論正常和OA軟骨細(xì)胞，與DEX-BSA組比較，RAPA+DEX-BSA組總LC3B、LC3B-Ⅱ、Beclin1和ULK1表達(dá)顯著增加(P<0.01)；與BSA組比，DEX-BSA組ULK1、Beclin1和總LC3B、LC3B-Ⅱ顯著下降(P<0.01)(表1)。

2.5 qRT-PCR測(cè)定LC3、ULK1、Beclin1、TNF-α和IL-1基因表達(dá)，ELISA法測(cè)定IL-1、TNF-α蛋白濃度

以GAPDH mRNA為內(nèi)參，無論正常和OA軟骨細(xì)胞，與BSA組比較，DEX-BSA組Beclin1、LC3和ULK1顯著下降(P<0.001)，TNF-α和IL-1顯著增加(P<0.01)；與DEX-BSA組比較，RAPA+DEX-BSA組LC3顯著增加(P<0.01)，TNF-α和IL-1顯著下降(P<0.01)。RAPA+DEX-BSA組與DEX-BSA組比，Beclin1(P=0.147)和ULK1(P=0.157)正常軟骨細(xì)胞無差異，OA軟骨細(xì)胞顯著增加(P<0.001)(表2)。IL-1、TNF-α蛋白濃度與基因表達(dá)相同，無論正常和OA軟骨細(xì)胞，與BSA組比較，DEX-BSA組顯著增高(P<0.001)；與DEX-BSA組比較，RAPA+DEX-BSA組顯著下降(P<0.01)(表3)。

圖 1mRFP-GFP-LC3腺病毒檢測(cè)自噬流情況

Fig1mRFP-GFP-LC3 adenovirus detected autophagic flow

2.6 自噬對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL法檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡小體(圖2)，進(jìn)行熒光分光光度分析。DEX-BSA組與BSA組相比，正常軟骨細(xì)胞(分別為0.037±0.003 7和0.032±0.006 8)升高不顯著(P=0.33)，OA軟骨細(xì)胞(分別為0.055±0.006 8和0.038±0.000 7)顯著升高(P<0.05)。RAPA+DEX-BSA組與DEX-BSA組比，正常軟骨細(xì)胞(0.046±0.000 7)升高(P<0.05)，OA軟骨細(xì)胞(0.062±0.003 0)無差異(P=0.16)。Annexin V-FITC/PI法進(jìn)一步明確自噬對(duì)凋亡的影響,無論正常和OA軟骨細(xì)胞，與BSA組(1.34%±0.20%和21.09%±0.73%)比較，DEX-BSA組(26.02%±0.86%和34.96%±0.68%)凋亡顯著增加(P<0.001)。與DEX-BSA組比，RAPA+DEX-BSA組(21.02%±0.76%和27.48%±0.81%)凋亡顯著降低(P<0.01)(圖 3)。

表1 各組細(xì)胞自噬相關(guān)基因的蛋白表達(dá)比較Table 1 Comparison of protein expression of autophagy related n=3)

表2 各組細(xì)胞自噬相關(guān)基因及炎性因子基因表達(dá)比較Table 2 Comparison of the expression of autophagy-related genes and inflammatory factor n=3)

表3 各組細(xì)胞炎性因子蛋白濃度比較 Table 3 Comparison of inflammatory factor protein concentration cells n=3, pg/ml)

圖 2TUNEL法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡

Fig2TUNEL detected chondrocyte apoptosis

圖 3Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡

Fig3Detection of apoptosis of chondrocytes by Annexin V-FITC/PI

3 討論

有研究證實(shí)DEX促進(jìn)軟骨細(xì)胞線粒體凋亡及軟骨基質(zhì)分解，引起細(xì)胞凋亡[3]。MTT法顯示無論正常或OA軟骨細(xì)胞，DEX處理后的存活率顯著下降(P<0.001)。為確定DEX對(duì)軟骨細(xì)胞的損傷作用，用Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)凋亡，無論正?；騉A軟骨細(xì)胞，與BSA組比較，DEX-BSA組凋亡顯著增加(P<0.01)。此外，TUNEL法檢測(cè)顯示，在OA軟骨細(xì)胞DEX處理后凋亡顯著升高(P<0.05)，表明DEX對(duì)軟骨細(xì)胞活性有影響。

對(duì)正常和OA軟骨細(xì)胞，DEX處理后ULK1、Beclin1、總LC3B和LC3B-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.01)；DEX處理后Beclin1、ULK1和LC3基因表達(dá)亦顯著下降(P<0.001)。mRFP-GFP-LC3腺病毒標(biāo)記自噬體熒光分光光度分析顯示，OA軟骨細(xì)胞DEX-BSA組比BSA組顯著降低(P<0.01)，表明DEX對(duì)軟骨細(xì)胞自噬有下調(diào)的影響。

研究發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞凋亡中炎癥因子起著重要作用[4]。抑制mTOR可以降低IL-1β的表達(dá)[5]。由軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞合成的IL-1β和TNF-α破壞軟骨損傷和修復(fù)過程的平衡[6]，是誘導(dǎo)和保持軟骨損傷狀態(tài)的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子。并且TNF-α能夠刺激蛋白多糖再吸收并抑制其合成[7]。IL-1β、TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生前列腺素和NO[8]，NO干擾軟骨細(xì)胞功能致基質(zhì)金屬蛋白酶活化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或抑制蛋白多糖和Ⅱ型膠原合成，進(jìn)一步導(dǎo)致軟骨基質(zhì)減少[9]。qRT-PCR和ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示無論正?；騉A軟骨細(xì)胞，DEX處理后IL-1β和TNF-α水平顯著升高(P<0.01)；預(yù)先2h加入RAPA處理正常和OA軟骨細(xì)胞，與DEX-BSA組比較，TNF-α和IL-1水平均顯著下降(P<0.05)，表明自噬對(duì)DEX引起的TNF-α和IL-1有影響。

RAPA抑制mTOR途徑而激活自噬[10]。本實(shí)驗(yàn)Western blot和qRT-PCR檢測(cè)LC3B、ULK1、Beclin1蛋白和基因表達(dá)結(jié)果表明，OA軟骨細(xì)胞中LC3B、ULK1、Beclin1的蛋白及基因表達(dá)均在RAPA干預(yù)后顯著升高。結(jié)果一致，無論正?；騉A軟骨細(xì)胞，mRFP-GFP-LC3自噬雙標(biāo)腺病毒標(biāo)記自噬體熒光分光光度分析顯示在RAPA干預(yù)后顯著增高，表明預(yù)先2 h加入RAPA有上調(diào)軟骨細(xì)胞自噬的作用。

自噬能清除細(xì)胞內(nèi)功能障礙的細(xì)胞器，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)而提高細(xì)胞的存活力[11]。細(xì)胞器的損傷在凋亡啟動(dòng)中發(fā)揮重要作用，及時(shí)地消除受損細(xì)胞器能夠延緩甚至使凋亡停止。有研究顯示軟骨細(xì)胞凋亡在軟骨退行性變過程中起關(guān)鍵作用[12]。因此，阻斷軟骨細(xì)胞凋亡可能減輕或避免細(xì)胞損傷，從而延緩或阻止OA發(fā)生。MTT法顯示，無論正?；騉A軟骨細(xì)胞，RAPA處理后活性顯著升高(P<0.001)。Annexin V-FITC/PI法顯示，RAPA+DEX-BSA組比DEX-BSA組凋亡顯著降低(P<0.01)，表明預(yù)先2 h加入RAPA能夠降低軟骨細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，本研究通過RAPA誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞自噬、抑制凋亡、減少TNF-α和IL-1的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞存活，為調(diào)節(jié)自噬預(yù)防和治療骨關(guān)節(jié)炎提供了研究基礎(chǔ)。