程濤，姚遠(yuǎn)，張生，張向?qū)帲瑥垚?ài)輝，楊威，侯崇智

(1 西安市兒童醫(yī)院，西安710002；2 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度大于200 bp的非編碼RNA分子，可通過(guò)在轉(zhuǎn)錄、翻譯、染色質(zhì)以及表觀(guān)遺傳學(xué)水平調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)而參與各類(lèi)生物學(xué)過(guò)程[1]。研究[2,3]發(fā)現(xiàn)，lncRNA可通過(guò)影響多種腫瘤細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程參與肝癌的發(fā)生發(fā)展。通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)腫瘤基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中肝癌臨床樣本的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)位于3號(hào)染色體3q22.1區(qū)段的一條lncRNA TMCC1-AS1在肝癌組織中呈高表達(dá)且與生存期負(fù)相關(guān)，提示TMCC1-AS1可能參與肝癌的發(fā)生發(fā)展，但生物學(xué)功能未見(jiàn)報(bào)道[4,5]。2018年6月～2018年12月，我們觀(guān)察了TMCC1-AS1在不同人肝癌細(xì)胞株和正常人肝細(xì)胞中的表達(dá)變化及沉默TMCC1-AS1對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721增殖、細(xì)胞周期、遷移的影響，探討TMCC1-AS1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑 人肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC-7721、Huh-7和正常人肝細(xì)胞株HL-7702均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)。TMCC1-AS1干擾RNA(siTMCC1-AS1)及陰性對(duì)照干擾RNA(siNC)均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，RNA提取試劑RNAiso Plus購(gòu)自日本TAKARA公司，轉(zhuǎn)染試劑PowerFectTM購(gòu)自美國(guó)SignaGen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑HiFiScript cDNA Synthesis Kit和實(shí)時(shí)熒光定量試劑FastSYBR Mixture購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司，CCK-8試劑購(gòu)自日本DOJINDO公司，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Transwell小室(8 μm)購(gòu)自美國(guó)康寧公司，DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清及青霉素鏈霉素雙抗均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 人肝癌細(xì)胞株與正常肝細(xì)胞中TMCC1-AS1的檢測(cè) 人肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC-7721、Huh-7和正常人肝細(xì)胞株HL-7702均采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5%CO2條件下在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用RNAiso Plus試劑提取細(xì)胞總RNA，隨后分別采用反轉(zhuǎn)錄試劑HiFiScript cDNA Synthesis Kit和實(shí)時(shí)熒光定量試劑FastSYBR Mixture進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR反應(yīng)。TMCC1-AS1上游引物為5′-GCCAGAGCGACGGTTGGA-3′，下游引物為5′-GGCTGCGTTCGATGGGTG-3′；以GAPDH為內(nèi)參，其上游引物為5′-CCCTTCATTGACCTCAACTACATG-3′，下游引物為5′-TGGGATTTCCATTGATGACAAGC-3′。PCR反應(yīng)體系共50 μL：2×FastSYBR Mixture 25 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性20 s，95 ℃變性3 s，60 ℃退火延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt表示細(xì)胞中TMCC1-AS1的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 SMMC-7721細(xì)胞的TMCC1-AS1 siRNA轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞周期比例、遷移能力觀(guān)察

1.3.1 SMMC-7721細(xì)胞的TMCC1-AS1 siRNA轉(zhuǎn)染及分組 將SMMC-7721細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞融合度達(dá)到30%～50%時(shí)，參照PowerFectTM試劑說(shuō)明書(shū)分別轉(zhuǎn)染siTMCC1-AS1及陰性對(duì)照siNC，分別記為沉默組和對(duì)照組。兩組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，參照“1.2”檢測(cè)轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞中TMCC1-AS1的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2 轉(zhuǎn)染后兩組SMMC-7721細(xì)胞增殖能力觀(guān)察 采用CCK-8法。兩組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，胰酶消化收集細(xì)胞，用完全細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，以2 000個(gè)/孔的密度接種于96孔板，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。兩組各設(shè)置4行(分別對(duì)應(yīng)4個(gè)時(shí)間點(diǎn))，每行5個(gè)復(fù)孔，分別于培養(yǎng)24、48、72、96 h時(shí)，加入10 μL CCK-8試劑，于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1.5 h后，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處各孔的光密度(OD)值，以O(shè)D值表示細(xì)胞增殖能力。

1.3.3 轉(zhuǎn)染后兩組SMMC-7721細(xì)胞周期比例觀(guān)察 采用流式細(xì)胞術(shù)。兩組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，以1×106個(gè)/孔密度接種于6孔板中，用預(yù)冷的75%乙醇于4 ℃條件下固定過(guò)夜，PBS洗滌細(xì)胞后，采用細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒中的碘化丙啶(PI)染色液避光孵育25 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組細(xì)胞周期，采用FlowJo軟件分析處于不同周期的細(xì)胞比例。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.4 轉(zhuǎn)染后兩組SMMC-7721細(xì)胞遷移能力觀(guān)察 采用Transwell小室法。兩組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，收集細(xì)胞用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，以50 000個(gè)/孔的密度接種于Transwell小室上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液作為趨化介質(zhì)，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞并用0.1%結(jié)晶紫染色20 min，用棉簽小心擦掉Transwell膜內(nèi)層未遷移細(xì)胞，于倒置顯微鏡下觀(guān)察遷移細(xì)胞數(shù)，以遷移細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞遷移能力。每組隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 人肝癌細(xì)胞株與正常肝細(xì)胞中TMCC1-AS1相對(duì)表達(dá)量比較 人肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC-7721、Huh-7和正常人肝細(xì)胞株HL-7702中TMCC1-AS1相對(duì)表達(dá)量分別為3.450±0.309、5.340±0.535、4.270±0.252和1.000±0.068，人肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC-7721、Huh-7中TMCC1-AS1相對(duì)表達(dá)量與正常人肝細(xì)胞株HL-7702相比，P均<0.01。

2.2 轉(zhuǎn)染后兩組SMMC-7721細(xì)胞中TMCC1-AS1相對(duì)表達(dá)量比較 沉默組SMMC-7721細(xì)胞中TMCC1-AS1相對(duì)表達(dá)量為0.34±0.11，對(duì)照組為1.00±0.04，兩組相比，P<0.01，提示沉默TMCC1-AS1的SMMC-7721細(xì)胞模型成功建立。

2.3 轉(zhuǎn)染后兩組SMMC-7721細(xì)胞增殖能力比較 沉默組培養(yǎng)24、48、72、96 h時(shí)的OD值分別為0.316±0.028、0.402±0.033、0.726±0.065、0.934±0.073，對(duì)照組培養(yǎng)24、48、72、96 h時(shí)的OD值分別為0.362±0.031、0.613±0.048、1.025±0.083、1.384±0.115，兩組相比，P均<0.05。

2.4 轉(zhuǎn)染后兩組SMMC-7721細(xì)胞周期比例比較 沉默組G0/G1期、S期細(xì)胞比例分別為62.6%±3.7%、20.4%±1.8%，對(duì)照組G0/G1期、S期細(xì)胞比例分別為54.4%±3.9%、26.5%±1.9%，兩組相比，P均<0.01；沉默組G2/M期細(xì)胞比例為16.4%±1.5%，對(duì)照組G2/M期細(xì)胞比例為17.6%±1.9%，兩組相比，P>0.05。

2.5 轉(zhuǎn)染后兩組SMMC-7721細(xì)胞遷移能力比較 沉默組與對(duì)照組細(xì)胞遷移數(shù)量分別為(112±11)個(gè)和(188±13)個(gè)，兩組相比，P<0.01。

3 討論

肝癌作為臨床上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其全球發(fā)病率在所有腫瘤中居第6位，而死亡率則居第4位。目前認(rèn)為，肝癌發(fā)生與乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染、長(zhǎng)期酗酒、肝硬化、黃曲霉毒素?cái)z入、代謝性疾病等因素密切相關(guān)，但其確切的發(fā)病機(jī)制，尤其是分子機(jī)制仍不清楚[6]。因此，解析肝癌發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制、開(kāi)發(fā)有效的早期診斷和預(yù)后標(biāo)志物以及治療靶點(diǎn)顯的十分迫切和必要。

近年來(lái)研究[7,8]發(fā)現(xiàn)，lncRNA作為一類(lèi)新型的調(diào)控分子，在各種腫瘤組織和細(xì)胞中異常表達(dá)，發(fā)揮致癌作用或抑癌作用，其可通過(guò)復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制參與包括肝癌在內(nèi)的各類(lèi)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前，已有一大批肝癌相關(guān)lncRNAs被鑒定出來(lái)，發(fā)現(xiàn)其在肝癌組織和細(xì)胞中表達(dá)失調(diào)，其可通過(guò)作用細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過(guò)程參與肝癌的發(fā)生發(fā)展[9]。研究[10～13]發(fā)現(xiàn)，HULC作為一條經(jīng)典的肝癌相關(guān)lncRNA，在肝癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，可通過(guò)調(diào)控miR-372、p18、SPHK1、ZEB1、USP22、COX-2和HMGA2等下游分子，影響肝癌細(xì)胞的增殖、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、血管新生、轉(zhuǎn)移、自噬、化療耐藥等腫瘤生物學(xué)行為。研究[14～18]顯示，HOTAIR作為經(jīng)典的促癌lncRNA，可通過(guò)調(diào)控SETD2、SUZ12、ZNF198、P14、P16、GLUT1、MMP9、ATG3和ATG7等分子的表達(dá)，進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移、葡萄糖代謝、自噬等生物學(xué)特性。

TMCC1-AS1是一條長(zhǎng)度為3 497 bp的lncRNA，在人類(lèi)基因組上與蛋白編碼基因TMCC1呈頭對(duì)頭排列，二者啟動(dòng)子區(qū)域重疊，轉(zhuǎn)錄方向相反。Cui等[4]對(duì)TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中肝癌和正常肝組織的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)和臨床病例資料進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)TMCC1-AS1在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)水平與患者生存期呈負(fù)相關(guān)。在另一項(xiàng)研究中，Zhao等[5]對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中370例肝癌組織和50例癌旁組織的lncRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)和臨床資料進(jìn)行分析，同樣發(fā)現(xiàn)了TMCC1-AS1在肝癌組織中呈高表達(dá)，并通過(guò)多變量比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)TMCC1-AS1的表達(dá)水平與患者的總生存期呈負(fù)相關(guān)，可作為獨(dú)立的預(yù)后判斷指標(biāo)。以上基于生物信息學(xué)的研究結(jié)果提示，TMCC1-AS1可能作為促癌lncRNA參與肝癌的發(fā)生發(fā)展，但目前仍缺乏直接的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本研究首先檢測(cè)了TMCC1-AS1在不同人肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示人肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC-7721、Huh-7中TMCC1-AS1相對(duì)表達(dá)量均高于正常人肝細(xì)胞株HL-7702，表明TMCC1-AS1可能作為促癌lncRNA參與肝癌發(fā)生發(fā)展。本研究進(jìn)一步利用RNA干擾技術(shù)沉默了SMMC-7721細(xì)胞的TMCC1-AS1表達(dá)水平，并對(duì)細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞周期變化及遷移能力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，沉默TMCC1-AS1可抑制SMMC-7721細(xì)胞的增殖、遷移能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期?？傊?，本研究結(jié)果表明，TMCC1-AS1在人肝癌細(xì)胞株中的上調(diào)表達(dá)與細(xì)胞的惡性腫瘤生物學(xué)行為密切相關(guān)，其可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖與遷移進(jìn)而參與肝癌的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，TMCC1-AS1在人肝癌細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào)；沉默TMCC1-AS1可抑制人肝癌細(xì)胞株的增殖和遷移。本研究初步明確了TMCC1-AS1在肝癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能，為進(jìn)一步探討其作用機(jī)制提供了依據(jù)。