范超萌，林書祥，李璇，王維，方玉蓮，彭林

(1天津醫(yī)科大學(xué)，天津 300070；2天津市兒童醫(yī)院；3天津市兒科研究所)

艱難梭菌(CD)又稱難辨梭狀芽孢桿菌，是一種專性厭氧、革蘭陽性的條件致病菌,是醫(yī)院獲得性腹瀉的常見致病菌[1]。最早從新生兒的糞便中分離得到。根據(jù)其是否產(chǎn)生致病性，可將其分為產(chǎn)毒菌株和非產(chǎn)毒菌株，其中產(chǎn)毒菌株可產(chǎn)生A/B毒素，引起CD相關(guān)性腹瀉；非產(chǎn)毒菌株可在宿主體內(nèi)定植，但并不具致病性。當(dāng)患者長期大量使用抗生素，造成腸道菌群失調(diào)后，CD便會大量增殖，產(chǎn)生大量毒素，引起一系列的腸道癥狀。臨床表現(xiàn)可從輕度的自限性腹瀉到嚴(yán)重偽膜性腸炎、膿毒綜合征和中毒性巨結(jié)腸，甚至于出現(xiàn)腸穿孔等嚴(yán)重后果。既往研究認(rèn)為， CD感染主要發(fā)生于年老體弱或長期使用抗生素的住院患者，兒童并不是CD的易感人群。但最近數(shù)據(jù)表明，兒童及無抗生素應(yīng)用史者CD感染的病例數(shù)逐漸增多[2]。各地區(qū)對CD的檢測分析認(rèn)為，CD感染多見于病程慢性遷延性腹瀉患兒，而病毒性腹瀉則主要表現(xiàn)為急性起病，且通常1～2 d可以緩解,但近年臨床上不斷出現(xiàn)急性起病的腹瀉患兒經(jīng)常規(guī)抗病毒治療仍反復(fù)發(fā)作的情況。2017年8月～2018年7月，我們對1 590份急性腹瀉患兒的糞便標(biāo)本進行了CD感染檢測，同時觀察其與腸道致瀉病毒的合并感染情況，并對檢測陽性患兒的臨床特征進行分析。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2017年8月～2018年7月就診于天津市兒童醫(yī)院疑似病毒感染的急性腹瀉患兒糞便標(biāo)本1 590例份，其中男941例份、女649例份(糞便性狀為稀便、水樣便、黏液膿血便，每日次數(shù)不限)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合腹瀉診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡1～192個月，根據(jù)CD感染的有關(guān)文獻，將其分為<3個月、3個月～1歲、1～4歲、4～12歲、12～18歲；③初次發(fā)病<2周或經(jīng)抗病毒治療后反復(fù)發(fā)作者；④無其他相關(guān)病史、藥物使用史的限制。排除標(biāo)準(zhǔn)：①明確為其他原因造成的腹瀉；②資料不完整者；③依從性差，不能配合標(biāo)本留取者。本研究獲得天津市兒童醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患兒家屬均簽署知情同意書。

1.2 細(xì)菌基因組DNA的提取 糞便標(biāo)本(-80 ℃保存)經(jīng)室溫解凍后，用TIANGEN DNA/RNA共提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)進行核酸DNA的提取，并將提取的糞便基因組DNA于-20 ℃保存。

1.3 CD毒素A/B(Tcd-A/B)基因檢測 將預(yù)存的基因組DNA于室溫下溶解，用PCR法檢測其毒素基因。Tcd-A/B分別由基因Tcd-A、Tcd-B編碼，Tcd-A所用引物為NK1(正向引物)5′-GGACATGGTAAAGATGAATTC-3′, NK2(反向引物) 5′-CCCAATAGAAGATTCAATATTAAGCTT-3′，目的片段為546 bp；Tcd-B所用引物為NK104(正向引物)5′-GTGTAGCAATGAAAGTCCAAGTTTACGC-3′，NK105(反向引物)5′-CACTTAGCTCTTTGATTGCTGCACCT-3′，目的片段為204 bp。每次反應(yīng)均設(shè)立空白對照，在GeneBank中對引物序列進行BLAST比對，結(jié)果證明所得產(chǎn)物確實為Tcd-A/B的編碼基因,反應(yīng)體系共25 μL，反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性10 min，然后94 ℃變性40 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。所得產(chǎn)物取5 μL點樣于1.5%的瓊脂糖凝膠，95 V電泳20～30 min，將膠塊置于凝膠成像系統(tǒng)下曝光，觀察有無特異性擴增的條帶。

1.4 其他病毒的檢測 用金標(biāo)法檢測所有標(biāo)本輪狀病毒、嗜熱彎曲菌(輪狀病毒、嗜熱彎曲菌檢測試劑盒，艾博生物醫(yī)藥杭州有限公司)的感染情況，同時用PCR法對所有標(biāo)本進行腺病毒、諾如病毒(NoV)、博卡病毒檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料用頻數(shù)、百分比表示，比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病原學(xué)檢測結(jié)果 1 590例份急性腹瀉患兒標(biāo)本有79例份Tcd檢測陽性，陽性率為4.97%；NoV陽性410例份，陽性率25.79%；二者合并感染21例份，混合感染率26.58%(21/79)。在Tcd陽性的患兒中，僅Tcd-B陽性(A-B+)63例(A-B+組)，陽性率為3.96%，Tcd-A、Tcd-B均陽性(A+B+)16例(A+B+組)，陽性率為1.01%，未檢測到僅Tcd-A(A+B-)陽性患兒。

2.2 CD感染患兒的年齡和性別分析 在79例份Tcd檢測陽性標(biāo)本中，患兒男43例(4.57%)、女36例(5.55%)，性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.09,P=0.76)；年齡最大者136個月，最小者1個月，中位年齡12個月，平均年齡23.24個月，≤3個月者8例(4.91%)，3個月～1歲者43例(4.90%)，1～4歲者19例(4.94%)，4～12歲者9例(5.66%)，不同年齡段間Tcd的陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.14，P=0.99)。

2.3 CD感染的季節(jié)分析 春季患兒563例，Tcd陽性44例，Tcd陽性檢出率為7.82%；夏季患兒320例，Tcd陽性18例，Tcd陽性檢出率為5.63%；秋季患兒135例，Tcd陽性2例，Tcd陽性檢出率為1.48%；冬季患兒572例，Tcd陽性15例，Tcd陽性檢出率為2.62%。CD陽性檢出率在季節(jié)分布中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.44，P=0.09)。

2.4 Tcd陽性患兒的一般臨床特征 79例份陽性標(biāo)本中，病程<2周者67例(84.81%)，病程在2周～2個月者11例(13.92%)，病程>2個月者1例(1.27%)。稀便53例(67.09%)，水樣便22例(27.85%)，便中帶血4例(5.06%)。大便頻次<3次/d者42例(53.16%)，3～5次/d者25例(31.65%)，5～10次/d者5例(6.33%)，>10次/d者7例(8.86%)?；純撼篂a外，還伴有其他臨床癥狀，其中伴肺炎33例，支氣管炎10例，哮喘3例，膿毒癥6例，支原體感染2例，泌尿系感染8例，中耳炎5例；脫水8例，代謝性酸中毒13例，低鉀血癥6例，嘔吐38例，發(fā)熱70例，貧血31例，低蛋白血癥10例，CRP升高27例，白細(xì)胞增高24例，白細(xì)胞減低12例，粒細(xì)胞減少29例，白血病7例；使用抗生素65例。

2.5 A+B+組與A-B+組臨床特點比較 通過對A+B+組與A-B+組的臨床資料進行對比，得知兩組之間在性別比、年齡病程、腹瀉次數(shù)、抗生素使用情況、發(fā)熱比例、貧血比例、CRP、白細(xì)胞等比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。其中A+B+組男9例、女7例，平均年齡20.88個月，病程6.63 d，腹瀉次數(shù)3.31次，使用抗生素者14例(87.5%)，發(fā)熱患兒16例(100%)，貧血患兒6例(37.5%),白蛋白減低者2例(12.5%)，CRP均值29.28 mg/L，白細(xì)胞均值8.26×109/L。A-B+組男34例、女29例，平均年齡20.47個月，病程10.29 d，腹瀉次數(shù)4.38次，使用抗生素者52例(82.81%)，發(fā)熱患兒55例(87.5%)，貧血患兒25例(39.06%),白蛋白減低者8例(12.70%)，CRP均值19.80 mg/L，白細(xì)胞均值8.95×109/L。

2.6 混合感染 79例份Tcd檢測陽性患兒標(biāo)本中，檢測到腺病毒陽性4例(5.06%)，輪狀病毒陽性11例(13.93%)，NoV陽性21例(26.58%)，博卡病毒陽性0例。

3 討論

CD是一種革蘭陽性專性厭氧產(chǎn)芽孢菌，在自然環(huán)境中廣泛存在，是一種條件致病菌。CD以滋養(yǎng)體和芽孢兩種存在形式，形成休眠體的芽孢可在艱難環(huán)境條件下生存數(shù)十年，并能抵抗多種理化因素的干擾。在機體免疫力正常時可在腸道內(nèi)定植，而不出現(xiàn)腹瀉等臨床癥狀。近年來，隨著抗生素及免疫制劑在兒科的廣泛使用，CD感染在兒科的發(fā)病率逐年升高。Kim等[3]對美國22所兒童醫(yī)院住院患兒的CD發(fā)病率進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),2001～2006年CD的發(fā)病率從2.6‰增加到4.0‰，呈穩(wěn)步增長趨勢。而國內(nèi)最早關(guān)于CD的研究報道是2009年Cheng等[4]在香港的研究，其收集的723份糞便標(biāo)本中，CD陽性37份，陽性率為5.1%。本研究對天津市兒童醫(yī)院急性腹瀉患兒CD的檢測，共檢出79份陽性標(biāo)本，陽性率為4.97%，低于2015年蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院的12.5%[5],2010年上海地區(qū)的14.41%[6]，2015年武漢地區(qū)的22.2%[7]，同時，與鄰近的北京地區(qū)相比，低于2012年郭姝等[8]的37.6%，2015年趙春娜等[9]的49.6%，而與2014年廣州地區(qū)的6.8%[10]，2015年深圳地區(qū)的5.93%[11]，2015年珠江地區(qū)的4.76%[12]較接近，表明在急性腹瀉患兒中可出現(xiàn)CD感染，但其陽性率低于慢性腹瀉遷延性腹瀉患者，其中在NoV陽性的410例患兒中，21例同時合并CD感染，表明NoV與CD可存在合并感染，在79例陽性患兒中，有65(82.28%)例患兒可確定入院前后曾用抗生素，可見患兒Tcd的感染情況與抗生素使用史有關(guān)，不同地區(qū)Tcd陽性率存在較大差異，這可能與不同地區(qū)醫(yī)療衛(wèi)生部門抗生素使用習(xí)慣有關(guān)。

在79例陽性患兒中，Tcd-A、Tcd-B均陽性(A+B+)者為16例，占陽性患兒的20.25%，Tcd-B陽性而Tcd-A陰性(A-B+)者63例，占陽性患兒的79.75%，此與2015年北京地區(qū)[9]的流行情況(Tcd-A、Tcd-B均陽性者占20%，僅Tcd-B陽性者占80%)較為一致，而美國、歐洲、亞洲的研究中，不同地區(qū)A-B+菌株的流行率不同，在美國約0.2%，歐洲為2.5%～3.0%，日本為6.7%～39.0%[13]，上海為33.3%，而朝鮮為17.6%～54.8%[14]，表明不同地區(qū)Tcd的流行菌株不同，而2012年郭姝等[8]對北京地區(qū)的研究中，僅Tcd-B陽性患兒占比為5.7%，不同于2015年北京地區(qū)的研究[9],表明同一地區(qū)不同時間段Tcd的流行菌株存在差異。

在Tcd檢測陽性的79例患兒中，男43例(54.43%)，女36例(45.57%)，不同性別患兒Tcd的陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明CD的感染情況與患兒性別無關(guān)。對1 590例患兒按年齡段進行分組研究，結(jié)果顯示，各年齡段間的陽性檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，各年齡段均可發(fā)病，本研究中，3個月～1歲患兒占比最高，與選取的標(biāo)本主要集中在3個月～1歲有關(guān)，而4～12歲患兒陽性率略高于其他年齡段，不同于2015年程國平[7]等的研究(CD感染陽性率最高的患兒集中在3個月～1歲)。對1590例患兒按季節(jié)分組進行研究，不同季節(jié)感染率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而對1 590份標(biāo)本按季節(jié)進行研究，各個月份間的陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與其他地區(qū)研究一致。

在檢測陽性的79例患兒中，其中有稀便、水樣便的患兒占94.93%，與Sammons等[15]研究結(jié)果類似。82.28%的患兒有抗生素使用史，與2017年王小燕等[16]報道一致，高于2015年李英杰等[5]的報道，79例陽性患兒除了腹瀉癥狀外，同時伴有嘔吐48.10%、發(fā)熱88.61%、貧血39.24%、CRP增高34.18%、白蛋白減低12.66%、粒細(xì)胞減低36.71%，與趙春娜等[9]研究一致。將79例患兒分為A+B+組與A-B+組進行比較，兩組在性別比、年齡、病程、腹瀉次數(shù)、抗生素使用情況、發(fā)熱比例、貧血比例、CRP、白細(xì)胞等比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與2015年趙春娜等[9]研究一致。

綜上所述，本研究中在Tcd檢測陽性的菌株以A-B+為主，未檢測到A+B-的標(biāo)本，患兒的陽性率低于北京、蘇州的多個地區(qū)，可能與本地區(qū)良好的抗生素使用習(xí)慣有關(guān)。因此，合理使用抗生素，做好院內(nèi)感染防護工作，維護環(huán)境衛(wèi)生，維持腸道微生態(tài)平衡對降低CD的感染率至關(guān)重要。