李小燕，謝永紅，楊麗

(廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院一五七分院，廣州 510510)

宮頸癌是常見的女性惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于乳腺癌。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年約有53萬宮頸癌新發(fā)病例[1]。人乳頭瘤病毒(HPV)感染是誘發(fā)宮頸癌的首要危險(xiǎn)因素。此外，吸煙、多孕多產(chǎn)等亦是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素[2]。手術(shù)、放療和化療是宮頸癌的一線治療方案。目前臨床仍缺乏特異度、靈敏度較高的宮頸癌靶標(biāo)。微小RNA(miRNAs)是由21～25核苷酸組成的非編碼RNA，可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)。目前已證實(shí)，miRNAs在細(xì)胞的各種生理過程中均發(fā)揮作用，且miRNAs異常表達(dá)可導(dǎo)致疾病發(fā)生，包括惡性腫瘤[3]。根據(jù)miRNAs靶基因的功能，miRNAs可同時(shí)兼具促癌基因和抑癌基因功能。miR-196a被證實(shí)可促進(jìn)胃癌[4]、肝癌[5]和子宮內(nèi)膜癌[6]等惡性腫瘤形成，同時(shí)胰腺癌患者血清miR-196a表達(dá)增加，且血清miR-196a表達(dá)與臨床分期和生存時(shí)間相關(guān)[7]。Liu等[8]發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中miR-196a表達(dá)增加，而宮頸癌患者血清中miR-196a表達(dá)表達(dá)是否增加目前尚不清楚。

2014年1～12月，我們檢測(cè)了宮頸癌患者血清miR-196a表達(dá)，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年1～12月入住我院的宮頸癌患者80例，納入標(biāo)準(zhǔn)：①具備完整病歷資料；②病理診斷證實(shí)為宮頸癌；③術(shù)前未接受放化療等抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他婦科疾??；②合并其他惡性腫瘤；③合并肝腎等重要器官功能不全；④年齡>70歲；⑤失訪病例。80例宮頸癌患者年齡25～70(50.12±6.32)歲，其中≤50歲者46例，>50歲者34例。腫瘤直徑：≤4 cm者51例，>4 cm者29例。病理分級(jí)：G1級(jí)28例，G2級(jí)24例，G3級(jí)28例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者49例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者31例。HPV感染：無HPV感染4例，有HPV感染76例。國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期：Ⅰ期56例，Ⅱ期24例。以確診時(shí)間為起點(diǎn)，以門診、電子通訊的方式，對(duì)宮頸癌患者進(jìn)行隨訪調(diào)查，直至患者死亡或隨訪時(shí)間結(jié)束(2018年9月)。同期選取于我院體檢的80例女性健康志愿者作為對(duì)照，年齡24～68(50.64±7.04)歲。宮頸癌患者與健康對(duì)照者年齡比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得我院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 血清miR-196a表達(dá)檢測(cè) 抽取所有研究對(duì)象(宮頸癌患者術(shù)前，健康志愿者體檢時(shí))晨起空腹外周靜脈血5 mL，4 ℃、2 000 r/min離心5 min，收集上層血清，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?yán)格參照血清miRNA提取試劑盒miRVanTMPARISTMkit(美國Ambion公司)說明書操作，加入 TRIzol試劑1 mL，室溫靜置5 min裂解細(xì)胞。加入氯仿，劇烈搖晃10 s后，室溫靜置5 min；15 000 r/min，4 ℃低溫離心15 min，取上清，與等體積異丙醇混勻，室溫靜置10 min； 4 ℃、15 000 r/min離心15 min，棄上清，加乙醇洗滌， 4 ℃、15 000 r/min離心15 min，棄上清，即可得RNA沉淀；加入適量DEPC水溶解，采用微量紫外分光光度計(jì)(NanoDrop2000，美國Thermo公司)檢測(cè)RNA濃度和純度[光密度(OD)260/OD280值為1.8～2.0)]。采用TaqMan?miRNA reverse transcription kit(美國ABI公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，嚴(yán)格參照試劑盒說明進(jìn)行操作，產(chǎn)物cDNA置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎肨aqMan microRNA檢測(cè)試劑盒(美國ABI公司)檢測(cè)血清miR-196a表達(dá)，反應(yīng)體系為10 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)熱10 min，95 ℃15 s、60 ℃1 min，共40個(gè)循環(huán)。miR-196a正向引物：5′-CGTCAGAAGGAATGATGCACAG-3′，反向引物：5′-ACCTGCGTAGGTAGTTTCATGT-3′；U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。以U6為內(nèi)參，2-ΔΔCT法計(jì)算miR-196a的相對(duì)表達(dá)量，其中CT=宮頸癌患者(CTmiR-196a-CTU6)-健康志愿者(CTmiR-196a-CTU6)，每個(gè)樣本進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)后，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以上指標(biāo)檢測(cè)由第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)廣東金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心操作。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌患者與健康志愿者血清miR-196a表達(dá)比較 宮頸癌患者、健康志愿者血清miR-196a相對(duì)表達(dá)量分別為3.17±1.63、0.95±0.21，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.082，P=0.000)。

2.2 血清miR-196a表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 宮頸癌患者血清miR-196a表達(dá)與患者年齡、腫瘤病理分級(jí)、HPV感染無關(guān)(P均>0.05)；宮頸癌患者血清miR-196a表達(dá)與患者腫瘤直徑、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和FIGO分期有關(guān)(P均<0.05)，即腫瘤直徑>4 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO分期為Ⅱ期的患者血清miR-196a表達(dá)高于腫瘤直徑≤4 cm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO分期為Ⅰ期的患者(P均<0.05)，見表1。

表1 宮頸癌患者血清miR-196a表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 血清miR-196a表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系 以血清miR-196a相對(duì)表達(dá)量的平均值為界限，將宮頸癌患者分為miR-196a高表達(dá)組(>平均值)42例和miR-196a低表達(dá)組(≤平均值)38例。建立生存率分析的Kaplan-Meier乘積極限模型(圖1)。結(jié)果顯示，miR-196a高表達(dá)組中位生存時(shí)間為26.2個(gè)月，3年生存率為38.10%(16/42)。miR-196a低表達(dá)組中位生存時(shí)間為38.3個(gè)月，3年生存率為71.05%(27/38)，均優(yōu)于miR-196a高表達(dá)組。經(jīng)Log-Rank檢驗(yàn)，兩組3年生存率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 5.082，P=0.024)。

圖1 宮頸癌患者Kaplan-Meier生存曲線

2.4 血清miR-196a表達(dá)對(duì)宮頸癌的診斷價(jià)值 將血清miR-196a相對(duì)表達(dá)量劃分為若干組段，建立ROC曲線分析模型。取約登指數(shù)(靈敏度+特異度-1)最大點(diǎn)為最佳臨界值/理論閾值。結(jié)果顯示，約登指數(shù)最大點(diǎn)為0.597，理論閾值點(diǎn)(血清miR-196a相對(duì)表達(dá)量)為1.37，對(duì)應(yīng)的靈敏度為0.832，特異度為0.765，ROC曲線下面積(AUC)為0.853，見圖2。

圖2 血清miR-196a診斷宮頸癌的ROC曲線

3 討論

miRNAs表達(dá)異常與腫瘤形成和惡性進(jìn)展密切相關(guān)。因此，與腫瘤臨床病理特征和患者預(yù)后相關(guān)的miRNAs分子具有作為腫瘤靶標(biāo)的價(jià)值。目前，miR-196家族共發(fā)現(xiàn)miR-196a-1、miR-196a-2和miR-196b三個(gè)成員，其中miR-196a基因定位于HOX基因簇中[9，10]，miR-196a異常表達(dá)在腫瘤形成中發(fā)揮重要作用。miR-196a參與了腫瘤發(fā)生、細(xì)胞分化、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)和病毒防御等多個(gè)重要生理過程[6，11]。研究[12]發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合檢測(cè)血清miR-196a和miR-196b有助于舌癌的早期診斷。Zhang等[13]發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤患者的血清miR-196a和miR-196b表達(dá)升高，且可作為預(yù)測(cè)患者不良預(yù)后的靶標(biāo)。此外，血清miR-196a和miR-196b可作為侵襲性胃癌的新靶標(biāo)。本研究之前，我們以miRNA芯片雜交檢測(cè)法篩選了體外宮頸癌細(xì)胞系的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-196a存在高度表達(dá)異常，因此推測(cè)miR-196a對(duì)于宮頸癌可能存在診斷價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示，宮頸癌患者血清miR-196a表達(dá)高于健康志愿者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多項(xiàng)研究證實(shí)，miR-196a在宮頸癌組織、宮頸癌細(xì)胞中均表達(dá)增加[8, 14]。由此推測(cè)，miR-196a可能參與并促進(jìn)了宮頸上皮癌變過程，具有促癌基因功能。本研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤直徑>4 cm患者的血清miR-196a表達(dá)高于腫瘤直徑≤4 cm患者，提示miR-196a可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖。Hou等[15]發(fā)現(xiàn)，miR-196a可通過調(diào)節(jié)FOXO1和p27Kip1基因表達(dá)，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖；Zhang等[16]在宮頸癌細(xì)胞中增加miR-196a表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖，并通過降低NTN4基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)。一個(gè)miRNAs分子可靶向多個(gè)基因表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)活性，后續(xù)研究中我們將尋找miR-196a可能靶向的其他與腫瘤增殖相關(guān)的基因，進(jìn)一步闡述miR-196a調(diào)控宮頸癌細(xì)胞增殖的具體機(jī)制。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者血清miR-196a表達(dá)較高，提示miR-196a可能促進(jìn)了宮頸癌細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Tsai等[17]在胃癌細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)，miR-196a可下調(diào)Radixin基因表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞侵襲，且在食管鱗狀細(xì)胞癌中，miR-196a可通過調(diào)節(jié)RAP1A基因表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞侵襲[18]。參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞侵襲遷移的基因甚多，后續(xù)我們將在體外細(xì)胞水平繼續(xù)尋找miR-196a靶基因，尤其是與腫瘤侵襲遷移相關(guān)的靶基因。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)IGO分期較高的宮頸癌患者血清miR-196a表達(dá)較高，提示監(jiān)測(cè)宮頸癌患者血清miR-196a表達(dá)有助于評(píng)估患者病情進(jìn)展，從而根據(jù)患者病情進(jìn)展及早給予相應(yīng)治療，以有效提高患者生存率并改善患者的預(yù)后。本研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-196a表達(dá)較高患者的3年總生存率較低、中位生存時(shí)間較短，患者預(yù)后較差.由此推測(cè)，宮頸癌患者血清miR-196a表達(dá)是宮頸癌患者預(yù)后的負(fù)性調(diào)控因子，與患者不良預(yù)后關(guān)系緊密，監(jiān)測(cè)宮頸癌患者血清miR-196a表達(dá)有助于對(duì)患者預(yù)后進(jìn)行初步判斷。而Yang等[19]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)miR-196a表達(dá)受抑制時(shí)，宮頸癌細(xì)胞的增殖與侵襲均受到抑制，提示監(jiān)控miR-196a表達(dá)可用于評(píng)估宮頸癌的惡性程度，有助于臨床及時(shí)調(diào)整治療方案，從而改善患者預(yù)后。血液檢查具有方便、簡單等特性，在腫瘤診斷方面具有較高的應(yīng)用前景。本研究采用ROC曲線檢驗(yàn)血清miR-196a表達(dá)對(duì)宮頸癌患者診斷的價(jià)值，結(jié)果顯示，血清miR-196a表達(dá)對(duì)宮頸癌診斷的靈敏度為0.832，特異度為 0.765，AUC為0.832，AUC>0.7則反映預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性較高，由此推測(cè)，血清miR-196a是診斷宮頸癌的較好指標(biāo)。

綜上所述，宮頸癌患者的血清miR-196a表達(dá)增高，且與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、FIGO分期、3年生存率相關(guān);監(jiān)測(cè)血清miR-196a表達(dá)有助于對(duì)患者病情進(jìn)展和預(yù)后進(jìn)行評(píng)估，同時(shí)血清miR-196a表達(dá)對(duì)宮頸癌診斷有較高價(jià)值。