雞大腸桿菌的分離與鑒定

才興蔓

（遼寧省葫蘆島市龍港區(qū)雙樹(shù)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，遼寧葫蘆島 125101）

1 分離實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

（1）病料來(lái)源

某肉種雞場(chǎng)30周齡羅斯308種雞10只。無(wú)菌條件下剖檢取病雞的心、肝、脾、腎等實(shí)質(zhì)臟器3份，置冰箱4℃保存，備用。

（2）培養(yǎng)基

普通營(yíng)養(yǎng)肉湯、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、兔鮮血營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、伊紅美瓊脂平板、三糖鐵瓊脂斜面、半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂均按常規(guī)方法[9、10、11]自行配制。

（3）微量發(fā)酵管

糖微量發(fā)酵管由杭州天和微生物試劑有限公司提供。

（4）藥敏試紙

藥敏試紙由杭州天和微生物試劑有限公司提供。

（5）抗O因子血清

大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)O1、O2、O35、O78血清型均購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

（6）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

小白鼠由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，每只體重約20g，31周齡羅斯308肉種雞由大連莊河金泉種禽繁育有限公司提供，每只體重約3kg。

（7）主要儀器與設(shè)備

JP-A型架盤(pán)天平、自動(dòng)立式電熱蒸氣壓力消毒器（YX-350型）、DHG-9245A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、打孔器恒溫箱、凈化臺(tái)（超凈工作臺(tái)SW-CJ-IF型）、0.5號(hào)麥?zhǔn)蠁挝荒z乳濁度比濁管新華一號(hào)定性濾紙、顯微鏡、染缸、可調(diào)式微量移液器、玻璃儀器。

1.2 方法

（1）病料的采集

在剖檢病雞時(shí)無(wú)菌取病雞的心、肝、脾、腎等實(shí)質(zhì)臟器3份，置冰箱4℃保存，備用。

（2）細(xì)菌的分離培養(yǎng)

①平板劃線分離培養(yǎng) 細(xì)菌的分離培養(yǎng)方法有劃線法和傾注法兩種，本實(shí)驗(yàn)采用劃線法。無(wú)菌條件下將病料分別接種于普通肉湯37℃培養(yǎng)24h后，接種于麥康凱瓊脂平板，繼續(xù)培養(yǎng)24h。

②細(xì)菌的純化 觀察麥康凱瓊脂平板上分離培養(yǎng)的菌落，選純紅色典型菌落，標(biāo)記后，接種營(yíng)養(yǎng)肉湯進(jìn)行純培養(yǎng)，24h后接種普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，進(jìn)一步接種伊紅美蘭瓊脂、SS瓊脂、血液瓊脂平板37℃培養(yǎng)24h。

（3）細(xì)菌的形態(tài)學(xué)觀察

細(xì)菌標(biāo)本片制作的基本步驟：觸片→干燥→固定→染色→鏡檢。

（4）生化試驗(yàn)

取細(xì)菌純培養(yǎng)物接種五種糖類(lèi)微量發(fā)酵管（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖發(fā)酵管），置37℃培養(yǎng)48h后進(jìn)行觀察。并按常規(guī)方法接種三糖鐵瓊脂斜面和進(jìn)行吲哚試驗(yàn)、M-R試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂穿刺試驗(yàn)并觀察試驗(yàn)結(jié)果。

（5）藥物敏感試驗(yàn)

①菌液準(zhǔn)備 釣取麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上單個(gè)菌落，接種于普通肉湯，37℃ 培養(yǎng)l0h，其濁度相當(dāng)于0.5號(hào)麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)，此時(shí)肉湯中活菌數(shù)為1X108CFU/mL。如肉湯中細(xì)菌濁度超過(guò)0.5號(hào)麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)，用無(wú)菌生理鹽水或營(yíng)養(yǎng)肉湯稀釋至0.5號(hào)麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)相同的濁度。

②接種平板 用無(wú)菌棉簽吸取調(diào)節(jié)好濃度的菌液，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板表面涂抹接種，務(wù)必將細(xì)菌菌液涂布均勻。

③在瓊脂平板上貼加抗菌藥敏片 用滅菌尖頭鑷子夾取各種抗菌藥藥敏紙片，按一定密度分別貼到上述已涂布細(xì)菌的培養(yǎng)基表面，用鑷子清壓，確保藥敏紙片與瓊脂表面完全接觸.紙片貼完15 min后將平板翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，底部在上，置37℃ 恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)l8h，取出觀察，記錄結(jié)果。

（6）分離血清型鑒定

挑取純培養(yǎng)的菌落接種于液體（處理過(guò)的肉湯）培養(yǎng)基，37%培養(yǎng)12h后煮沸2h，經(jīng)500Or/min，棄去上清，加入生理鹽水作適度稀釋。用一張清潔的玻板，取標(biāo)準(zhǔn)抗“O”單因的凝集現(xiàn)象。同時(shí)用生理鹽水代替血清做對(duì)照組。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果鑒定部分

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上37℃培養(yǎng)24～48h后，形成中等大小、圓形微凸起、表面光滑濕潤(rùn)、半透明灰白色菌落；在麥康凱瓊脂上形成中等大小，表面光滑濕潤(rùn)的磚紅色菌落；在伊紅美藍(lán)瓊脂上形成紫黑色帶金屬光澤的菌落；在SS瓊脂上生長(zhǎng)較差呈紅色；在血液瓊脂上出現(xiàn)菌落較大，有粘性邊緣整齊、并有隆起的灰白色菌落，呈完全溶血；分離菌在肉湯中培養(yǎng)18～24 h，呈均勻混濁，管底有淡白色粘稠沉淀，部分菌株可在肉湯表面形成菌環(huán)。

2.2 細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察

病雞心、肝腎等組織培養(yǎng)物涂片、染色、鏡檢，均可見(jiàn)兩端鈍圓，多數(shù)散在排列，偶爾有2～3個(gè)連在一起的革蘭氏陰性短桿菌。

2.3 生物化學(xué)試驗(yàn)

生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)菌在三糖鐵培養(yǎng)基上生長(zhǎng)表面產(chǎn)酸，底部產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不產(chǎn)生H2S，初步鑒定是大腸桿菌。從表1可以看出，此次分離的大腸桿菌對(duì)葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖酵解產(chǎn)酸產(chǎn)氣，M-R和靛基質(zhì)試驗(yàn)、運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性，V-P、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)呈陰性，符合大腸桿菌的生化特性[8]。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)抑菌圈的大小可見(jiàn)：該菌對(duì)阿米卡星、恩諾沙星極度敏感；對(duì)卡那霉素、慶大霉素、氟苯尼考高度敏感；對(duì)環(huán)丙沙星、沙拉沙星、阿莫西林中度敏感；對(duì)諾氟沙星、土霉素低度敏感；對(duì)頭孢唑啉鈉、新霉素、紅霉素、新諾明、氨芐西林不敏感。

2.5 分離菌的血清型鑒定

根據(jù)玻版的凝集情況顯示：本次實(shí)驗(yàn)分離到的致病性大腸桿菌菌株主要為O78型。