■楊桂林 肖 丹 潘康成

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動物微生態(tài)研究中心，四川成都611130）

黃曲霉毒素是一類由某些真菌產(chǎn)生的毒素，廣泛存在于玉米、花生、谷類等農(nóng)作物籽實(shí)中，對食品業(yè)和畜牧業(yè)造成了巨大的危害。奶牛攝入黃曲霉毒素會導(dǎo)致其采食量下降，免疫力下降，內(nèi)臟器官受損甚至癌變，產(chǎn)奶量下降等危害，且飼喂黃曲霉毒素時(shí)間越長，危害越大[1]。黃朝芳等[2]發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素可對水產(chǎn)動物有肝毒性、致癌性、致畸性、致突變和免疫抑制等危害。趙紅梅等[3]發(fā)現(xiàn)，豬黃曲霉素中毒導(dǎo)致出現(xiàn)食欲減退、腹瀉、皮炎、共濟(jì)失調(diào)、死亡等癥狀。家禽黃曲霉毒素中毒表現(xiàn)為肝臟、腎臟、腸道等內(nèi)臟器官損傷，口腔潰爛、免疫功能下降、產(chǎn)蛋下降、生長速度下降等癥狀[4]。減少食品及飼料中的黃曲霉毒素殘留，降低黃曲霉毒素對畜禽和人類的威脅迫在眉睫。

1 黃曲霉毒素的脫除方法

控制黃曲霉素中毒發(fā)生最常用的方法是做好防霉工作，如將飼料放置在干燥的地方，在飼料中添加防霉劑等。而對于存在于原料或飼料中的黃曲霉毒素，高效的黃曲霉毒素脫除方法就顯得尤其重要了。目前，黃曲霉毒素的脫除方法主要包括物理脫除法、化學(xué)脫除法、生物脫除法，但由于黃曲霉毒素的性質(zhì)穩(wěn)定，導(dǎo)致對使用物理脫除法和化學(xué)脫除法時(shí)采取的反應(yīng)條件較高，因此可能對飼料中營養(yǎng)成分的破壞較大，同時(shí)可能造成其它有毒物質(zhì)的殘留[5]。隨著酶工程，基因工程等學(xué)科的發(fā)展，生物脫除技術(shù)由于其反應(yīng)條件溫和，降解效率高，不會產(chǎn)生對人和動物有害的物質(zhì)，已成為最優(yōu)的黃曲霉毒素降解方法之一[6]。生物脫除法即利用微生物或其代謝產(chǎn)物進(jìn)行解毒[7]，目前國際上已發(fā)現(xiàn)的可降解黃曲霉毒素的微生物有芽孢桿菌[8]、乳酸菌[9]、釀酒酵母[10]、鼠李糖乳桿菌[11]、橙色黃桿菌[12]、樹狀指孢霉[13]、分支桿菌胞外提取物[14]等。

2 益生芽孢桿菌降解黃曲霉毒素的研究

益生芽孢桿菌是一類嚴(yán)格好氧或兼性厭氧的革蘭氏陽性菌，廣泛分布于水、空氣、塵粒、土壤中，并能通過呼吸、飲水、采食等進(jìn)入動物腸道內(nèi)[15-17]。目前，益生芽孢桿菌已廣泛應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)中，其種類包括枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等[18]。益生芽孢桿菌可以降解黃曲霉素[19]、有機(jī)磷農(nóng)藥[20]、撲草凈[21]、多菌靈[22]、玉米霉烯酮、嘔吐毒素[23]等有毒物質(zhì)。

2.1 益生芽孢桿菌在體外降解黃曲霉毒素

益生芽孢桿菌在體外降解黃曲霉毒素的能力可以利用來減少農(nóng)產(chǎn)品中產(chǎn)黃曲霉毒素真菌的滋生及黃曲霉毒素的殘留，以提升食品及畜禽飼料的安全性。RAO 等[24]以香豆素作為唯一碳源，分離出7種在液體培養(yǎng)基中使黃曲霉毒素降解70%以上的菌株，其中一菌株降解率甚至達(dá)到了94.7%，經(jīng)16SrRNA 測序鑒定出該菌株屬于地衣芽孢桿菌。Farzaneh 等[25]報(bào)道了從開心果中分離的枯草芽孢桿菌UTBSP1 對黃曲霉毒素降解率可以達(dá)到95%。Gao 等[26]從魚的腸道中分離出枯草芽孢桿菌ANSB060，該菌株對黃曲霉毒素B1、M1 和G1 降解率分別為81.5%、60%和80.7%，此外，他們所分離的菌株可以抑制病原體的生長并抵抗模擬腸道環(huán)境中的不利條件。Petchkongkaew 等[27]將分別從泰國北部的大豆和新鮮豆豉分離出來的23 株芽孢桿菌與一株產(chǎn)黃曲霉毒素的菌株共同培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)芽孢桿菌均可以抑制毒株的生長和降解黃曲霉毒素，且降解能力最強(qiáng)的兩種菌株分別為枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。Siahmoshteh 等[19]對兩種芽孢桿菌的抗霉菌和抗黃曲霉菌毒素能力進(jìn)行了評估，發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)菌菌株在體外條件下和開心果籽中均顯示出良好的抗霉菌活性和黃曲霉毒素降解能力，為芽孢桿菌屬物種開發(fā)、對抗產(chǎn)毒性真菌的生長和農(nóng)作物的黃曲霉毒素污染生物防治劑提供了依據(jù)。Galarza-Seeber 等[28]通過利用體外消化模型模擬體內(nèi)條件，對適應(yīng)體內(nèi)生理環(huán)境的芽孢桿菌降解黃曲霉素的能力進(jìn)行了評估，發(fā)現(xiàn)對黃曲霉毒素具有強(qiáng)降解能力的3 株菌株，分別為解淀粉芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌。這些具有體外降解黃曲霉毒素能力的益生芽孢桿菌，都具有開發(fā)為生物制劑的潛能。

2.2 益生芽孢桿菌在體內(nèi)降解黃曲霉毒素

將益生芽孢桿菌制成微生態(tài)制劑添加到畜禽的飼料中，其進(jìn)入動物胃腸道，發(fā)揮益生作用，若其具有降解黃曲霉毒素的能力，當(dāng)畜禽受到含有黃曲霉毒素的飼料威脅時(shí)，可以為畜禽提供一定的保護(hù)力，幫助動物代謝黃曲霉毒素，降低黃曲霉毒素的危害及黃曲霉毒素的殘留。Fan 等[29]通過對照試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌ANSB060 可以抵消黃曲霉毒素對肉雞生長性能的影響和對肉質(zhì)的破壞作用，同時(shí)能減少喂食天然發(fā)霉花生粕的肉雞肝臟中黃曲霉毒素殘留量。Ma等[30]研究了一株分離自魚腸的枯草芽孢桿菌對飼喂黃曲霉毒素蛋雞蛋品質(zhì)、蛋雞肝臟、腎臟生化和組織病理學(xué)變化的保護(hù)作用，結(jié)果顯示該芽孢桿菌可以增強(qiáng)蛋雞抗氧化活性，恢復(fù)肝臟中的蛋白質(zhì)合成，此外，還改善了肝臟和腎臟組織的損傷，并使其恢復(fù)正常。王大才等[31]在含有黃曲霉毒素B1 的基礎(chǔ)日糧中添加枯草芽孢桿菌制劑，發(fā)現(xiàn)在黃曲霉毒素B1 含量為55 μg/kg 時(shí)，枯草芽孢桿菌制劑的添加量為0.2% 時(shí)其解毒效果最好，基本減輕或消除黃曲霉毒素B1 對黃河鯉魚生長、血清相關(guān)酶活和蛋白指標(biāo)、營養(yǎng)物質(zhì)消化率及肝、肌肉黃曲霉毒素B1 殘留的不良影響。Fan 等[32]還研究發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素會增加血清中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性，降低血清中谷胱甘肽過氧化物酶活性，增強(qiáng)血清和肝臟中丙二醛含量，引起肝組織嚴(yán)重的病變，如膽管上皮增生、空泡變性和淋巴細(xì)胞浸潤等，但飼喂枯草芽孢桿菌可降低十二指腸中的黃曲霉毒素水平，并抵消黃曲霉毒素的負(fù)面影響，從而得出枯草芽孢桿菌對飼喂黃曲霉毒素的肉雞具有保護(hù)作用的結(jié)論。宋文靜等[33]研究表明，在肉鴨日糧中添加益生芽孢桿菌制劑可以有效降低黃曲霉毒素在肝臟、肌肉組織中的殘留。Barati等[34]研究發(fā)現(xiàn)使用益生芽孢桿菌+乳桿菌+釀酒酵母細(xì)胞壁制成的混合微生態(tài)制劑可以控制黃曲霉毒素對體液和細(xì)胞免疫系統(tǒng)的抑制作用，這種制劑通過降低黃曲霉毒素的抗?fàn)I養(yǎng)作用，同時(shí)改善蛋白質(zhì)合成過程，增加抗體產(chǎn)生和對綿羊血紅細(xì)胞注射的反應(yīng)，從而提出使用益生元和益生菌的混合物控制黃曲霉毒素對雛雞的影響，改善免疫功能和生化途徑的方法。大量的研究發(fā)現(xiàn)了益生芽孢桿菌在體內(nèi)對黃曲霉毒素的降解能力及其對黃曲霉毒素對機(jī)體造成的不良影響的消除，為進(jìn)一步將益生芽孢桿菌開發(fā)成為防止畜禽黃曲霉毒素中毒的微生態(tài)制劑奠定了基礎(chǔ)。

3 益生芽孢桿菌降解黃曲霉毒素的可能機(jī)制

益生芽孢桿菌在生命活動中會產(chǎn)生一系列脂肽、蛋白質(zhì)、表面活性素等中間產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物，其中部分產(chǎn)物可能兼有對黃曲霉毒素的降解作用[35-42]。此外，由于益生芽孢桿菌的增殖周期較短，在與產(chǎn)黃曲霉毒素的真菌共存時(shí)，兩者競爭營養(yǎng)物質(zhì)、水等生存物資，從而與產(chǎn)黃曲霉毒素真菌形成拮抗作用。Gao 等[26]發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌培養(yǎng)72 h 后培養(yǎng)物上清液能夠降解78.7%的黃曲霉毒素B1，而活細(xì)胞和細(xì)胞提取物分別降解10.5%和9.6%，培養(yǎng)物上清液也具有強(qiáng)烈的黃曲霉毒素G1 和M1 降解活性，比活細(xì)胞和細(xì)胞壁提取物顯著，這表明該芽孢桿菌的降解黃曲霉毒素的活性物質(zhì)主要在其代謝產(chǎn)物中。Xu等[35]從玉米、水稻和土壤樣品中分離出43 種細(xì)菌，從中篩選了一株對黃曲霉毒素降解能力最強(qiáng)的菌株，經(jīng)鑒定其屬于芽孢桿菌屬，研究發(fā)現(xiàn)該菌株培養(yǎng)上清液比活細(xì)胞和細(xì)胞提取物降解更多的黃曲霉毒素，且在蛋白酶K 和十二烷基硫酸鈉存在時(shí)，降解活性從77.9%降低到15.3%。他們發(fā)現(xiàn)將上清液培養(yǎng)24 h后的黃曲霉毒素降解能力通過超濾濃縮50倍后從47.6%增加至70.1%，并且與蛋白質(zhì)濃度呈正相關(guān)，他們再將上清液煮沸10 min，毒素降解能力沒有改變。他們進(jìn)一步從煮沸的上清液中純化出了這些熱穩(wěn)定酶，命名為芽孢桿菌黃曲霉毒素降解酶（BADE）。Xia 等[36]從土壤中分離出可以抑制黃曲霉生長和降解黃曲霉毒素的枯草芽孢桿菌JSW-1，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌JSW-1 的黃曲霉毒素降解活性主要?dú)w因于無細(xì)胞上清液，且活性物質(zhì)同樣耐高溫但對蛋白酶K 敏感，表明益生芽孢桿菌的胞外蛋白或酶具有黃曲霉毒素降解活性。Mohsen 等[37]用枯草芽孢桿菌UTBSP1 處理開心果，可使開心果中的黃曲霉毒素含量減少，用熒光探針法發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌UTBSP1 的無細(xì)胞上清液顯著影響孢子活力，使用高效液相色譜方法從無細(xì)胞上清液的甲醇提取物中分離了10 個(gè)組分，其中兩個(gè)組分具有抑制黃曲霉的能力。質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，兩種抗真菌組分的抗菌復(fù)合物、表面活性素的環(huán)脂肽和豐原素具有高度相似性，推測枯草芽孢桿菌是通過表面活性素與豐原素的協(xié)同作用產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗真菌作用。Mohammadipour等[38]從枯草芽孢桿菌分離出了許多表面活性素，發(fā)現(xiàn)純化的表面活性素對黃曲霉生長的具有強(qiáng)烈的抑制作用。Landy 等[39]從枯草芽孢桿菌分離得到了對黃曲霉毒素具有抑制作用的桿菌霉素D，桿菌霉素D是芽孢桿菌分泌的一種抗菌脂肽，屬于伊枯草菌素家族，對蛋白酶不敏感[40]。Gu 等[41]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，桿菌霉素D作用于真菌細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使其形態(tài)發(fā)生變化，誘導(dǎo)活性氧的積累，最終導(dǎo)致真菌死亡。Afsharmanesh等[42]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌UTB1 的黃曲霉毒素降解能力是基于參與桿菌溶素生物合成的氧化還原酶的產(chǎn)生。目前，還沒有形成益生芽孢桿菌降解黃曲霉毒素的作用機(jī)理的統(tǒng)一看法。

4 益生芽孢桿菌降解黃曲霉毒素的影響因素

4.1 菌種

菌種是影響益生芽孢桿菌降解黃曲霉毒素最主要的因素，不同的芽孢桿菌對黃曲霉毒素降解能力不盡相同，有些菌株甚至沒有降解黃曲霉毒素的能力。根據(jù)目前的研究結(jié)果來看，益生芽孢桿菌降解黃曲霉毒素的主要原因是能產(chǎn)生一些具有降解黃曲霉毒素活性的酶類、表面活性素等胞外代謝產(chǎn)物[35-42]。因此，選擇具有高效降解黃曲霉毒素的芽孢桿菌作為待選菌種就格外重要了，此外，芽孢桿菌作為一類常見的飼料添加劑，其益生的特性在選擇時(shí)也值得被考慮。若需將益生芽孢桿菌添加在飼料中作為預(yù)防黃曲霉毒素中毒的一種措施，最優(yōu)的選擇就是該益生芽孢桿菌既能增加動物的生長性能，增強(qiáng)動物的免疫力，又具有較好的黃曲霉毒素降解作用。若將益生芽孢桿菌作為體外發(fā)酵降解黃曲霉毒素的菌種時(shí)，盡可能高的黃曲霉毒素降解率就是選擇的首要考慮因素了。目前，枯草芽孢桿菌是最常見，且應(yīng)用最廣泛的益生芽孢桿菌。

4.2 環(huán)境

益生芽孢桿菌所處的環(huán)境對其降解黃曲霉素的能力具有巨大影響。有研究發(fā)現(xiàn)，有的益生芽孢桿菌在體外可以降解黃曲霉毒素，但通過拌料飼喂的時(shí)候卻未能表現(xiàn)明顯的黃曲霉毒素降解作用[43]。由于益生芽孢桿菌主要依靠其代謝產(chǎn)生的物質(zhì)來達(dá)到降解黃曲霉毒素的作用，而細(xì)菌的代謝產(chǎn)物是隨著環(huán)境的pH 值、溫度、濕度、含氧量等因素變化的，所以，確定適宜的培養(yǎng)條件，可以大大提高益生芽孢桿菌降解黃曲霉毒素的效率。Farzaneh等[25]發(fā)現(xiàn)無細(xì)胞上清液對黃曲霉毒素B1 降解的最佳溫度為35～40 ℃，最佳作用時(shí)間為24 h。Rao等[24]發(fā)現(xiàn)一株地衣芽孢桿菌最佳降解黃曲霉毒素B1的培養(yǎng)溫度為37 ℃，時(shí)間為24 h，pH值為7。

5 小結(jié)與展望

益生芽孢桿菌作為一類已被大眾廣泛認(rèn)可的益生菌，其無毒副作用、無殘留、效果顯著。由于益生芽孢桿菌能形成芽孢，其芽孢耐高溫、耐強(qiáng)酸堿，因此較其他益生菌而言，更適合運(yùn)輸、保存，通過動物腸胃的效率更高。目前，益生芽孢桿菌已作為微生態(tài)制劑添加在畜禽的飼料中，以調(diào)節(jié)動物的腸道微生態(tài)平衡、增強(qiáng)動物免疫功能、促進(jìn)消化與吸收、提高動物的生產(chǎn)性能等。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，霉菌毒素分解酶枯草桿菌制劑可以降低黃曲霉毒素在體內(nèi)的殘留，改善黃曲霉毒素B1 造成的肉雞生長受阻、免疫器官發(fā)育受損、抗氧化功能下降等現(xiàn)象。益生芽孢桿菌用來降解黃曲霉毒素的研究已經(jīng)有很長時(shí)間，目前已經(jīng)達(dá)到了應(yīng)用階段，但是關(guān)于益生芽孢桿菌桿菌降解黃曲霉毒素的機(jī)理卻依然不是很清楚。國內(nèi)外研究益生芽孢桿菌在體外降解黃曲霉毒素較多，但是益生芽孢桿菌桿菌在動物機(jī)體內(nèi)降解黃曲霉毒素，為動物的提供保護(hù)作用的相關(guān)研究卻較少。因此，我們還需要去發(fā)現(xiàn)更多對黃曲霉毒素有高效降解作用的益生芽孢桿菌，探究其降解黃曲霉毒素的作用機(jī)理。