陳蕾，李泉，高文風，孟潔，王愛紅，王占聚

(濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院，山東濰坊261031)

細胞間黏附分子1(ICAM-1)是黏附分子家族重要成員之一，不僅參與免疫細胞的識別和活化，還廣泛參與各種炎癥反應[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，ICAM-1在多種腫瘤細胞中也有表達，在腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[2]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，ICAM-1在人淋巴瘤Raji細胞中高表達。為進一步研究ICAM-1在淋巴瘤中的作用，2018年2～6月，我們構建了ICAM-1基因慢病毒干擾載體，包裝慢病毒并感染人淋巴瘤Raji細胞，抑制ICAM-1在Raji細胞中的表達，并觀察Raji細胞遷移及侵襲能力的變化，以期為淋巴瘤的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 質(zhì)粒pLKO.1-ICAM-1shRNA-GFP、psPAX2、pMD2.G、HEK293T細胞及人淋巴瘤細胞Raji為濰坊醫(yī)學院附屬醫(yī)院血液科實驗室常規(guī)保存；RPMI-1640培養(yǎng)基以及小牛血清購自杭州四季青公司；RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑、PCR試劑均購自大連TaKaRa公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；BCA蛋白濃度測定試劑、質(zhì)粒提取試劑、小鼠抗人β-actin單克隆抗體以及ECL發(fā)光試劑均購自碧云天生物技術研究所；兔抗人ICAM-1單克隆抗體、HRP標記的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG購自CST公司；Transwell檢測小室購自COSTAR公司，Matrigel膠購自BD公司；ICAM-1及β-actin引物由博尚生物技術公司合成。

1.2 慢病毒包裝及病毒滴度測定 人ICAM-1慢病毒載體的構建參照前期實驗方法[3]。常規(guī)培養(yǎng)HEK293T細胞并取對數(shù)生長期的細胞進行實驗，待HEK293T細胞匯合度達70%時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒并進行慢病毒包裝。慢病毒重組載體pLKO.1-ICAM-1shRNA-GFP質(zhì)粒6 μg、psPAX2質(zhì)粒4 μg、pMD2.G質(zhì)粒2 μg，加入opti-MEM至總體積300 μL，另取opti-MEM加入LipofectamineTM2000 36 μL至總體積300 μL，將上述液體混勻后緩慢加入含HEK293T細胞培養(yǎng)皿中，6 h后補足完全培養(yǎng)液至10 mL，48 h后收集細胞上清液并用0.45 μm濾器過濾，高速離心濃縮后得到ICAM-1慢病毒濃縮液，同法獲得無干擾能力的陰性對照病毒濃縮液。將HEK293T細胞接種于96孔板中并調(diào)整細胞為1×104/孔，將病毒濃縮液倍比稀釋后依次感染HEK293T細胞，24 h后以完全培養(yǎng)基代替病毒液繼續(xù)培養(yǎng)，觀察綠色熒光蛋白表達情況，計算病毒滴度(表達熒光的細胞數(shù)×稀釋倍數(shù))，并確定最佳感染復數(shù)(MOI)。熒光顯微鏡下可見細胞發(fā)出明亮綠色熒光，48 h后收集富含病毒顆粒的細胞上清液。測定病毒液感染HEK293T細胞的病毒滴度，計算病毒滴度為2×108TU/mL。取MOI為5、10、20的慢病毒液感染HEK293T細胞，熒光顯微鏡下可觀察到細胞發(fā)出明亮綠色熒光，表明慢病毒成功感染靶細胞。

1.3 Raji細胞內(nèi)ICAM-1基因沉默 常規(guī)培養(yǎng)Raji細胞并按照1×105/孔的密度接種于6孔板中，隨機分為空白對照組、NC組及干擾組。培養(yǎng)24 h后進行病毒感染，空白對照組不加處理，另兩組加入相應病毒液。將所制備慢病毒以5×MOI進行感染，加入終濃度為8 mg/L的聚凝胺以提高感染效率。感染8 h后換液并繼續(xù)培養(yǎng)，3 d后得到穩(wěn)定感染的細胞。

1.4 細胞內(nèi)ICAM-1 mRNA檢測 采用RT-PCR技術。TRIzol抽提Raji細胞總RNA并合成cDNA，取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL行PCR 擴增。引物序列：ICAM-1上游引物5′-ATGCCCAGACATCTGTGTCC-3′、下游引物5′-GGGGTCTCTATGCCCAACAA-3′；β-actin上游引物5′-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3′、下游引物5′-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3′。擴增條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min，ICAM-1擴增長度為112 bp，β-actin擴增長度為416 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳并拍照，用凝膠成像系統(tǒng)與Quantity one軟件進行圖像分析，以β-actin做內(nèi)參照，以目的基因與β-actin的灰度比值計算mRNA相對表達量。

1.5 細胞內(nèi)ICAM-1蛋白表達檢測 采用Western blotting法。離心收集Raji細胞，加入蛋白裂解液，冰上裂解1 h，離心收集蛋白并測定濃度，蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉溶液室溫孵育封閉2 h，加入兔抗人ICAM-1抗體(1∶1 000)和小鼠抗人β-actin抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，加入HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶1 000)和HRP標記的山羊抗小鼠IgG(1∶1 000)，室溫孵育2 h，TPST洗膜3次，ECL化學發(fā)光法顯色，顯影定影后將膠片拍照，Image J軟件行灰度值分析，以ICAM-1與內(nèi)參β-actin蛋白灰度值比值計算蛋白相對表達量。

1.6 細胞遷移能力檢測 采用細胞劃痕實驗。以1×105/mL的細胞密度將各組Raji細胞接種于包被有Matrigel的96孔板中，內(nèi)含10%胎牛血清的培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，直至形成細胞單層。采用無菌槍頭在培養(yǎng)板底部單層培養(yǎng)細胞上劃痕，洗滌3次后加入無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，加入10 g/mL絲裂霉素排除細胞增殖干擾，細胞劃痕后48 h在顯微鏡下觀察并測量細胞平均遷移距離，與0 h的初始距離作對比，計算細胞平均遷移率。細胞劃痕遷移率=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。實驗重復3次，取平均值。

1.7 細胞侵襲能力檢測 采用Transwell實驗。Transwell小室內(nèi)膜加入Matrigel膠并置于24孔板中，待膠凝固后實驗。取Raji細胞并調(diào)整細胞濃度為1×105/mL，200 μL/孔將細胞懸液加入Transwell小室，同時在Transwell下室中加入含10%小牛血清的培養(yǎng)基800 μL，37 ℃培養(yǎng)24 h后取出小室，用棉簽擦拭內(nèi)膜上的細胞，預冷甲醇固定30 min后棄掉甲醇，1%結晶紫染色20 min，倒置顯微鏡下隨機觀察5個視野并計數(shù)穿膜細胞數(shù)。重復實驗3次，取平均值。

2 結果

2.1 各組ICAM-1 mRNA表達比較 干擾組、NC組及空白對照組ICAM-1 mRNA相對表達量分別為0.29±0.06、1.12±0.05、1.05±0.02，干擾組ICAM-1 mRNA相對表達量低于NC組、空白對照組(P均<0.05)。

2.2 各組ICAM-1蛋白表達比較 干擾組、NC組及空白對照組ICAM-1蛋白相對表達量分別為0.35±0.06、1.07±0.01、1.01±0.04，干擾組ICAM-1蛋白相對表達量低于NC組、空白對照組(P均<0.05)。

2.3 ICAM-1基因沉默對Raji細胞遷移能力的影響 干擾組、NC組及空白對照組細胞遷移率分別為為35.92%±3.73%、64.25%±3.18%、61.25%±5.01%，干擾組細胞遷移率低于NC組、空白對照組(P均<0.05)。

2.4 ICAM-1基因沉默對Raji細胞侵襲能力的影響 干擾組、NC組及空白對照組細胞穿膜數(shù)分別為(63.40±6.54)、(74.20±4.09)、(78.60±1.52)個/視野，干擾組細胞穿膜數(shù)少于NC組、空白對照組(P均<0.05)。

3 討論

淋巴瘤是血液系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其在中國的發(fā)病率遠高于西方國家，嚴重危害人們的健康。雖然近年來對淋巴瘤的治療有了長足進步，但每年仍有大量患者死于淋巴瘤的轉(zhuǎn)移和復發(fā)[4]。目前研究表明，淋巴瘤的復發(fā)與轉(zhuǎn)移與細胞黏附分子有密切關系，細胞黏附分子通過促進腫瘤細胞與血管內(nèi)皮細胞及細胞外基質(zhì)細胞的黏附，在腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[5,6]。

ICAM-1是細胞黏附分子家族中的重要成員，其配體是淋巴細胞功能相關抗原1，參與各種細胞之間的黏附與識別[1,7,8]。有研究證實，ICAM-1在多種腫瘤細胞中均有表達，ICAM-1通過促進腫瘤細胞吸附于血管內(nèi)皮細胞或淋巴管內(nèi)皮細胞表面，促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。ICAM-1在多種腫瘤組織中呈高表達，且ICAM-1高表達的腫瘤患者多數(shù)預后較差[9～13]。有研究證實原癌基因Kras可促進胰腺腺泡細胞中ICAM-1表達，通過募集巨噬細胞在炎癥部位聚集促進癌前病變的形成[14]。轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)可提高ICAM-1表達促進骨肉瘤細胞的轉(zhuǎn)移[15]。下調(diào)ICAM-1表達或阻斷ICAM-1信號通路，可降低小鼠結腸癌細胞和乳腺癌細胞的遠端轉(zhuǎn)移能力[16,17]。有研究表明ICAM-1在淋巴瘤患者中呈高表達，并且與腫瘤細胞自分泌和血管內(nèi)皮細胞旁分泌有關。ICAM-1促進腫瘤細胞通過血液系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移擴散，并促進淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展[18,19]。有研究表明，ICAM-1可增強B細胞向脾和結外組織的遷移、極化和歸巢，最終通過激活核因子κB(NF-κB)和磷脂酰肌醇3激酶-絲/蘇氨酸蛋白激酶信號途徑促進B細胞向惡性轉(zhuǎn)化。ICAM-1還可介導中性粒細胞對各種淋巴瘤細胞的殺傷作用。T細胞淋巴瘤細胞可通過病毒調(diào)節(jié)蛋白Tax和NF-κB信號通路降低ICAM-1的表達，從而逃避機體免疫系統(tǒng)的識別與殺傷，阻斷ICAM-1的表達可有效抑制淋巴瘤細胞的轉(zhuǎn)移[20～23]。提示ICAM-1在淋巴瘤的發(fā)生發(fā)展過程中也起關鍵作用。

慢病毒介導的RNA干擾是近年來發(fā)展起來的一項新技術，能特異而有效地干擾靶基因的表達，具有轉(zhuǎn)染率高、穩(wěn)定性高及特異性強等特點[24]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，ICAM-1在人淋巴瘤Raji細胞內(nèi)高表達，為進一步研究并探討ICAM-1在淋巴瘤轉(zhuǎn)移中的作用，我們利用前期構建成功的ICAM-1慢病毒干擾載體[3]，用三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)進行慢病毒包裝并感染人淋巴瘤Raji細胞，抑制ICAM-1在Raji細胞中的表達并觀察細胞遷移侵襲能力的變化。結果證實ICAM-1慢病毒可有效下調(diào)Raji細胞中ICAM-1 mRNA和蛋白表達；細胞劃痕實驗和Transwell侵襲實驗結果證實下調(diào)ICAM-1表達后腫瘤細胞的遷移與侵襲能力均下降。提示靶向沉默ICAM-1基因表達可抑制人淋巴瘤Raji細胞的遷移與侵襲，研究結果有望為淋巴瘤的臨床治療提供新的思路與靶點。

綜上所述，沉默ICAM-1基因可抑制人淋巴瘤Raji細胞的遷移與侵襲。但本研究尚未明確具體的分子作用機制，將在今后的研究中進一步探討。