宋東坡，陳曉英，呂亞囡，王偉青，李文杰

(青島市婦女兒童醫(yī)院，山東青島266034)

楓糖尿癥(MSUD)是由支鏈酮酸脫氫酶復(fù)合體(BCKD)缺乏引起的一種罕見常染色體隱性遺傳病。BCKD主要由支鏈酮酸脫氫酶異聚體(E1)、二氫硫辛酰胺支鏈?；D(zhuǎn)移酶(E2)和二氫硫辛酰胺脫氫酶(E3)組成。其中E1由兩個E1α和兩個E1β亞單位組成。E1α亞單位由BCKDHA基因編碼合成，E1β亞單位由BCKDHB基因編碼合成。E2由DBT基因編碼合成，E3由DLD基因編碼合成。MSUD臨床罕見且病死率極高。本研究分析2014年8月～2017年4月收治的5例MSUD患兒的遺傳學(xué)病因，首次報道位點的致病性，同時初步討論突變類型與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患兒1(P1)，男，36周+4，順產(chǎn)，出生體質(zhì)量2.55 kg，出生7 d發(fā)病，表現(xiàn)為吃奶差，反應(yīng)性差；血串聯(lián)質(zhì)譜(MSMS)：總亮氨酸(LEU+ILE+PRO-OH) 1 609.43 μmol/L，(LEU+ILE+PRO-OH)/PHE 32.11，纈氨酸(VAL) 28.16 μmol/L；未行尿液串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS)檢測；于2歲1個月死亡?；純?(P2)，男，40周+3，順產(chǎn)，出生體質(zhì)量3.08 kg，出生4 d發(fā)病，表現(xiàn)為嗜睡，嗆奶，反應(yīng)性差；血MSMS：LEU+ILE+PRO-OH 2 360.96 μmol/L，(LEU+ILE+PRO-OH)/PHE 104.33，VAL 351.46 μmol/L；尿GC-MS：2-羥基異戊酸35.7，2-酮-異戊酸5.5，2-酮-3-甲基戊酸14.3，2-酮-異己酸8.5；于出生21 d死亡?；純?(P3)，女，36周+2，剖宮產(chǎn)，出生體質(zhì)量2.85 kg，出生6 d發(fā)病，表現(xiàn)為反應(yīng)性差，吃奶差；血MSMS：LEU+ILE+PRO-OH 2 419.1 μmol/L，(LEU+ILE+PRO-OH)/PHE 49.42，VAL 688.26 μmol/L；尿GC-MS：2-羥基異戊酸159.1，2-酮-異戊酸90.1，2-酮-3-甲基戊酸196.6，2-酮-異己酸178.1；于出生22 d死亡?；純?(P4)，女，41周+2，順產(chǎn)，出生體質(zhì)量3.55 kg，出生7 d發(fā)病，表現(xiàn)為嗜睡，反應(yīng)性差；血MSMS：LEU+ILE+PRO-OH 3 392.14 μmol/L，(LEU+ILE+PRO-OH)/PHE 70.3，VAL 1 080.17 μmol/L；尿GC-MS：2-羥基異戊酸7.7，2-酮-異戊酸3.1，2-酮-3-甲基戊酸9.5，2-酮-異己酸34.2；患兒自確診后接受治療與隨訪，出生10個月，生長發(fā)育落后，肌張力低，豎頭不穩(wěn)，尖足，眼神呆滯?；純?(P5)，男，38周+2，剖宮產(chǎn)，出生體質(zhì)量3.5 kg，出生7 d發(fā)病，表現(xiàn)為拒乳，反應(yīng)性差；血MSMS：LEU+ILE+PRO-OH 3 238.76 μmol/L，(LEU+ILE+PRO-OH)/PHE 60.5，VAL 549.9 μmol/L；尿GC-MS：2-羥基異戊酸19.59，2-酮-異戊酸32.4，2-酮-3-甲基戊酸5.4，2-酮-異己酸7.2；患兒自確診后接受治療和隨訪，出生10個月，生長發(fā)育基本正常，雙側(cè)下肢肌張力低，認(rèn)母，可逗笑，能與人交流。5例患兒父母表型均正常?；純焊改妇炇鹬橥鈺?，研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 基因測序 采用二代高通量測序技術(shù)。采集患兒外周血2 mL，外送金域臨床檢測中心進(jìn)行高通量測序分析。采用QIAampDNA提取試劑盒(QIAGEN公司)抽提基因組DNA，將DNA隨機(jī)打斷純化，進(jìn)行擴(kuò)增并連接接頭序列，經(jīng)過捕獲、純化及再擴(kuò)增獲得基因文庫。針對BCKDHA的9個外顯子，BCKDHB的10個外顯子，DBT的11個外顯子、DLD的14個外顯子進(jìn)行高通量測序。檢測結(jié)果用BWA算法與GenBank BCKDHA(NM-000709)、BCKDHB(NM-183050)、DBT(NM-001918)、DLD(NM-000108)參考序列比較，獲得可疑的突變位點，并進(jìn)行父母驗證證實突變來源。

1.3 突變位點生物學(xué)信息分析 采用PolyPhen2[1]、Mutation Taster[2]及SPANR[3]軟件預(yù)測突變對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能的影響; SWISS-MODEL軟件建模，BCKDHA突變的模板為2bff.1.A[4]，BCKDHB突變的模板為1olx.1.B[5]。PDB軟件分析氨基酸殘基的功能變化[6]，參考PDB代碼為1X7Y[7]。

2 結(jié)果

2.1 測序及父母驗證結(jié)果 結(jié)果顯示P1的BCKDHA攜帶c.940C>T及c.992dupA復(fù)合雜合突變，且分別來自患兒父母；P2的BCKDHB攜帶c.853C>T及c.1039-3C>A復(fù)合雜合突變，且分別來自患兒父母；P3的BCKDHB攜帶c.1046G>A及c.550delT復(fù)合雜合突變，且分別來自患兒父母；P4的BCKDHB攜帶c.383G>A及c.490G>A復(fù)合雜合突變，且分別來自患兒父母；P5的BCKDHB攜帶c.410C>T雜合突變，來自患兒母親。DBT和DLD未發(fā)現(xiàn)突變。其中c.1039-3C>A突變?yōu)閮?nèi)含子突變，其余突變均發(fā)生在外顯子區(qū)域。經(jīng)過檢索SNP、ExAC及1000G數(shù)據(jù)庫c.940C>T、c.853C>T、c.410C>T被ExAC收錄，具有SNP代碼；c.1046G>A具有SNP代碼；c.383G>A、c.940C>T雖被報道但未被以上數(shù)據(jù)庫收錄；c.550delT為本研究首次發(fā)現(xiàn)；c.992dupA、c.1039-3C>A為首次報道的新突變。

2.2 計算機(jī)軟件分析結(jié)果

2.2.1 突變位點保守性分析結(jié)果 除P2 c.1039-3C>A發(fā)生在內(nèi)含子外，其他突變均發(fā)生在高度保守的外顯子區(qū)域，見表1。PolyPhen2和Mutation taster兩種軟件得分越接近1越預(yù)示突變位點為保守位點，突變可能導(dǎo)致蛋白功能的改變而致??；SPANR適用于剪接錯誤突變的預(yù)測，當(dāng)Dpsi_Percentile得分小于3分時認(rèn)為能夠引起剪接突變而致病。另外，c.940C>T和c.853C>T突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)編碼提前終止，截短蛋白的產(chǎn)生必然發(fā)生剪接錯誤因此Dpsi_Percentile得分偏低。

表1 5例患兒基因突變情況及軟件預(yù)測結(jié)果

2.2.2 建模及PBD分析結(jié)果 P1 BCKDHA基因c.940C>T導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平p.R314*改變，編碼產(chǎn)生的截短蛋白比野生型減少132個氨基酸；c.992dupA導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平p.Y331*改變，編碼產(chǎn)生的截短蛋白較野生型減少115個氨基酸。PBD二級結(jié)構(gòu)顯示p.R314*改變使得編碼蛋白丟失9個α螺旋，2個β鏈和2個β轉(zhuǎn)角；p.Y331*改變使得編碼蛋白丟失8個α螺旋，1個β鏈和2個β轉(zhuǎn)角。P2 BCKDHB基因c.853C>T導(dǎo)致蛋白水平p.R285*改變，編碼產(chǎn)生的截短蛋白較野生型減少108個氨基酸。二級結(jié)構(gòu)顯示蛋白丟失6個α螺旋，4個β鏈。P3 BCKDHB基因c.550delT突變導(dǎo)致p.S184Pfs*46讀碼框移位，編碼產(chǎn)生的截短蛋白較野生型減少164個氨基酸，二級結(jié)構(gòu)顯示蛋白丟失10個α螺旋、1個β轉(zhuǎn)角、11個β折疊；P3 BCKDHB基因c.1046G>A錯義突變導(dǎo)致蛋白水平p.C349Y改變。P4 BCKDHB基因c.383G>A 錯義突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平p.G128E改變；c.490G>A錯義突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平p.A164T改變。P5 BCKDHB基因 c.410C>T錯義突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平p.A137V的改變。這幾個錯義突變可能導(dǎo)致編碼產(chǎn)生的蛋白于突變位點之后的二級結(jié)構(gòu)丟失。

3 討論

MSUD是一種罕見的隱形遺傳代謝病，總體患病率約為1∶185 000，在近親婚配率較高的阿拉伯和土耳其人群MSUD患病率較高[8～10]。我國由于MSMS開展的較晚，缺乏大數(shù)據(jù)統(tǒng)計，因此具體發(fā)病率不詳。本研究青島地區(qū)篩查24萬新生兒確診4例，門診接診外地患兒1例。MSUD的發(fā)病率雖然很低，但卻是一種嚴(yán)重威脅患者生命健康的疾病，患者由于BCKD活性完全或部分缺乏導(dǎo)致亮氨酸，異亮氨酸和纈氨酸等支鏈氨基酸在體內(nèi)蓄積，引發(fā)重度酮癥酸中毒、神經(jīng)功能損害、精神發(fā)育遲滯。2001年以前國內(nèi)外對該病遺傳學(xué)病因的研究報道認(rèn)為突變有34%發(fā)生在BCKDHA(E1α基因)基因上；29%在BCKDHB(E1β基因)基因上；24%在E2基因上；13%在E3基因上[11]。2007年德國報道的30個突變基因中，37%在BCKDHA上，46%在BCKDHB上，13%在E2基因上[12]。2013年Narayanan等[13]報道的印度南部地區(qū)發(fā)生在BCKDHA上和BCKDHB上突變均占46%，DBT基因突變占14%。由此可見BCKDHA和BCKDHB是MSUD患兒的主要突變基因，而E3基因的突變極為少見。本文報道的5例患兒中1例為BCKDHA突變導(dǎo)致，4例為BCKDHB突變導(dǎo)致，結(jié)合文獻(xiàn)報道中國發(fā)病情況[14～21]，其發(fā)病基因的比例為BCKDHB占60%，BCKDHA占28%，DBT占12%，E3未見。

本文報道的9個突變位點中c.940C>T、c.853C>T、c.1046G>A、c.383G>A、c.490G>A、c.410C>T均已報道過。c.550delT位點為本研究首次發(fā)現(xiàn);c.992dupA、c.1039-3C>A為首次報道突變。本文重點討論新突變位點對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的影響。位于BCKDHA基因第7外顯子的c.992dupA突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平p.Y331*改變，編碼產(chǎn)生的截短蛋白較野生型減少115個氨基酸。丟失的二級結(jié)構(gòu)中包含THDP輔助因子的連接位點336H[4]。由于BCKD結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性取決于THDP輔助因子和鉀離子的存在[22]，因此上述突變將明顯改變E1α以及與之相連接的E1β的空間結(jié)構(gòu)及功能。另外，由于突變導(dǎo)致編碼終止信號提前出現(xiàn)在第7外顯子上，很有可能導(dǎo)致無義介導(dǎo)的mRNA降解(NMD)，導(dǎo)致相對明確的功能丟失[23]。c.1039-3位于BCKDHB基因上最后一個外顯子5′端的剪接位點受體上，突變導(dǎo)致剪接位點受體丟失，由于人類剪接規(guī)律依照GU-AG規(guī)則，當(dāng)剪接位點受體丟失可能導(dǎo)致剪接方式發(fā)生改變從而使得外顯子變長，編碼產(chǎn)生加長蛋白產(chǎn)物,也可引發(fā)NMD的發(fā)生導(dǎo)致蛋白功能丟失而致病。

MSUD患兒臨床結(jié)局與BCKD的活性密切相關(guān)。75%的經(jīng)典型MSUD患者其BCKD的活性僅為正常人的0～2%，因此臨床損害最為嚴(yán)重。由于缺乏BCKD活性的直接數(shù)據(jù)支持，我們初步對MSUD臨床嚴(yán)重程度與基因突變類型的關(guān)系進(jìn)行了探討。目前MSUD嚴(yán)重程度與遺傳學(xué)病因的關(guān)系并不明確[24]。理論上，純合子突變更容易揭示突變與臨床表現(xiàn)的關(guān)系，但就目前的報道來看，除了近親婚配率高的人群純合突變率較高外，大多數(shù)患者為復(fù)合雜合突變。本文的5例MSUD患兒中有4例為復(fù)合雜合突變，1例為單雜合突變。該5例患兒雖然均被診斷為經(jīng)典型MSUD,但臨床表現(xiàn)嚴(yán)重程度不一。5例患兒均在出生后7 d內(nèi)發(fā)病，P1血中支鏈氨基酸以亮氨酸為主，纈氨酸升高不明顯，一直在門診接受治療；2歲1個月時由于重度酸中毒昏迷家長放棄治療而死亡。P2至P5血中總亮氨酸和纈氨酸水平均遠(yuǎn)高于正常水平。P2和P3雖經(jīng)過積極治療但是由于一直無法建立自主呼吸且長期昏迷家長放棄治療于生后20 d左右死亡。P4確診后早期進(jìn)行了規(guī)范治療但是由于家長配合性差，患兒腦部磁共振檢查顯示顱內(nèi)多發(fā)異常信號神經(jīng)系統(tǒng)不可逆受損，且生長發(fā)育落后。P5雖然初期腦部神經(jīng)系統(tǒng)存在異常信號但經(jīng)過規(guī)范治療及監(jiān)測，10個月大查體患兒雖雙側(cè)下肢肌張力低下，但俯臥位抬頭穩(wěn)，會逗笑，能與人交流，認(rèn)母偶有咿呀兒語，生長發(fā)育基本正常。P1至P3臨床損害嚴(yán)重，分析其基因突變類型發(fā)現(xiàn)3例患兒均存在翻譯提前終止的突變，截短蛋白及NMD機(jī)制的發(fā)生，導(dǎo)致mRNA降解，BCKD活性完全缺失可能是臨床損害嚴(yán)重的機(jī)制。P5雖僅檢測到一個雜合突變c.410C>T，但是結(jié)合患者血串聯(lián)結(jié)果、尿GC-MS結(jié)果和臨床表現(xiàn)診斷為經(jīng)典型MSUD。Nellis等[25]曾報道攜帶c.410C>T突變的淋巴細(xì)胞BCKD無活性，根據(jù)MSUD的遺傳規(guī)律不排除該患兒存在其他致病突變。一代測序以及MLPA技術(shù)可以進(jìn)一步針對內(nèi)含子和缺失重復(fù)突變進(jìn)行檢測幫助尋找遺傳學(xué)病因。MSUD多發(fā)于新生兒，早期診斷早期干預(yù)對提高患兒生命質(zhì)量至關(guān)重要[26]。

本研究選擇5例MSUD病例，并分析了新發(fā)現(xiàn)突變位點的致病性，明確了MSUD患兒的遺傳學(xué)病因。此5例MSUD病例突變基因的報道有利于世界MSUD基因熱點突變的統(tǒng)計，同時新位點的發(fā)現(xiàn)豐富了BCKDHA基因和BCKDHB基因的突變譜，為MSUD的診斷和治療以及產(chǎn)前診斷提供依據(jù)。