董瑩 丁金國 黃臻輝

摘 要 目的：對丹參酮ⅡA磺酸鈉原料生產(chǎn)工藝中的主要有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行純化和結(jié)構(gòu)鑒定。方法：采用制備高效液相色譜法，對其有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行富集和分離純化，最終獲得HPLC純度>98%的目標(biāo)組分。冷凍干燥后，分別進(jìn)行MS和NMR分析及結(jié)構(gòu)鑒定和解析。結(jié)果與結(jié)論：鑒定得到三種有關(guān)物質(zhì)，結(jié)構(gòu)確證為丹參酮ⅡB磺酸鈉、丹參酮Ⅰ磺酸鈉、紫丹參甲素磺酸鈉。這為丹參酮ⅡA磺酸鈉原料藥及制劑的質(zhì)量控制、標(biāo)準(zhǔn)提高和穩(wěn)定性研究提供對照品及依據(jù)。

關(guān)鍵詞 丹參酮ⅡA磺酸鈉 有關(guān)物質(zhì) 分離純化 結(jié)構(gòu)鑒定

中圖分類號：R917； R286 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1006-1533（2019）01-0070-04

Isolation and structure identification of sodium tanshinoneⅡA sulfonate

DONG Ying*， DING Jinguo， HUANG Zhenhui**

（Shanghai NO.1 Biochemical and Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200240， China）

ABSTRACT Objective： The purification and structure identification of the related substances remained in production process of the raw material of sodium tanshinoneⅡA sulfonate were performed. Methods： The related substances with HPLC purity over 98% were obtained by preparative HPLC after they were enriched， isolated and purified. After freeze-drying process， these substances were analyzed by MS and NMR and their structures were identified and elucidated. Results & Conclusion： Three related substances were obtained and confirmed as sodium tanshinoneⅡB sulfonate， sodium tanshinoneⅠ sulfonate and sodium przewaquinone sulfonate， respectively， which were provided reference samples and scientific basis for the quality control， standard improvement and stability study of the raw material and preparations of sodium tanshinoneⅡA sulfonate.

KEy WORDS sodium tanshinone ⅡA sulfonate； relative substances； isolation and purification； structure identification

丹參為唇形科鼠尾草屬植物，其根入藥，化學(xué)成分含脂溶性的二萜醌類和水溶性的酚酸類。丹參酮ⅡA磺酸鈉（sodium tanshinoneⅡA sulfonate，STS）是二萜醌類化合物丹參酮ⅡA經(jīng)磺化而得到的水溶性磺酸鹽。臨床數(shù)據(jù)和藥理學(xué)研究表明，由于其具有抗氧化活性、減少血栓形成、能夠降低缺血再灌注所產(chǎn)生的心肌線粒體脂質(zhì)體過氧化物的含量、改善心肌線粒體膜的流動性、促進(jìn)旁系血管再生及有效增加冠狀動脈流量，對冠心病心絞痛及胸悶、心肌梗死、室性早搏等有顯著療效[1-4]，其注射劑已在臨床上廣泛使用。

Wang等[5]從STS原料中通過色譜分離純化、LC- MSn和NMR鑒定推測出8種有關(guān)物質(zhì)；Zou等[6]從STS原料中通過色譜分離純化、UV、LC-MS和NMR鑒定推測出6種有關(guān)物質(zhì)。而其磺化過程中的副產(chǎn)物和雜質(zhì)成分研究還不夠完善，且該類化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，化學(xué)全合成難度大；同時，在STS原料生產(chǎn)和儲存過程中均存在產(chǎn)品不穩(wěn)定的現(xiàn)象，如酸性增強、有效成分降解、含量降低等等。由于在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中須監(jiān)控其有關(guān)物質(zhì)，因此，提供高純度的有關(guān)物質(zhì)對照品具有重要意義。隨著藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高，ICH指導(dǎo)原則要求盡可能提供單雜大于0.1%的有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和可能的產(chǎn)生機(jī)制、構(gòu)效關(guān)系和藥理毒理數(shù)據(jù)等[7]。本研究通過制備液相技術(shù)分離純化丹參酮ⅡA磺酸鈉原料中有關(guān)物質(zhì)的組分，并通過HPLC、MS和NMR分析鑒定出三種有關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)，分別確證為丹參酮ⅡB磺酸鈉、丹參酮Ⅰ磺酸鈉和紫丹參甲素磺酸鈉。

1 材料和方法

1.1 儀器與材料

Varian SD-1液相制備及色譜裝填系統(tǒng)，色譜柱L&L4001;（2.54 cm×25 cm），色譜柱L&L4002;（5.08 cm×25 cm）；色譜填料ODS-AQ（5 mm，12 nm）和色譜填料PLRP-S（10 mm，10 nm）均購自日本YMC公司；Waters 2695/2489高效液相色譜儀（美國Waters公司）；色譜柱Extend C18 （4.6 mm×150 mm，5 mm，美國Agilent公司）；400M核磁共振波譜儀（NMR Avance Ⅲ400 MHz，瑞士Bruker公司）；超高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀（Acquitytim UPLC&Q-TOF; MS Premier，美國Waters公司）。

STS原料、純化水（本公司自制）；甲醇和三乙胺（TEA）（色譜純，美國Tedia公司）。

1.2 方法

1.2.1 STS樣品處理

取STS原料8.0 g進(jìn)行樣品前處理，用純化水配制成10 mg/ml的STS溶液，在37 ℃條件下減壓旋蒸結(jié)晶后經(jīng)濾紙過濾除去析出的固體沉淀，濾液經(jīng)過0.22 mm有機(jī)相微孔濾膜過濾除菌，得到STS原料供試樣品。

取STS原料60.0 g，甲醇3.8 L，投入5 L反應(yīng)瓶中，攪拌加熱，澄清后加入16 g藥用活性炭，控溫65 ℃條件下加熱至回流并保持此狀態(tài)50 min，抽濾后減壓旋蒸結(jié)晶后濾紙過濾除去析出的固體沉淀，濾液經(jīng)過0.22 mm有機(jī)相微孔濾膜過濾除菌，得到STS精制液供試樣品。

1.2.2 有關(guān)物質(zhì)的富集和一步純化

選用裝填PLRP-S聚合物填料的Varian L&L4002;色譜柱。上樣體積800 ml，流速為100 ml/min，柱溫為25℃，檢測波長為271 nm。流動相A為甲醇，流動相B為水，在0～8 min以20%A+80%B洗脫，8～70 min以20%A+80%B繼續(xù)梯度洗脫至80%A+20%B。根據(jù)紫外檢測結(jié)果實時收集STS有關(guān)物質(zhì)富集樣品。

1.2.3 有關(guān)物質(zhì)二步純化及精制

選用裝填ODS-AQ硅膠填料的Varian L&L4001;色譜柱。上樣體積800 ml，流速為25 ml/min，柱溫為25 ℃，檢測波長為271 nm。流動相A為含0.1% TEA的甲醇溶液，流動相B為含0.1% TEA的水溶液，在0～8 min以20%A+80%B洗脫，8～30 min以20%A+80%B繼續(xù)梯度洗脫至40%A+60%B，根據(jù)紫外檢測結(jié)果實時收集STS有關(guān)物質(zhì)精制樣品。

1.2.4 有關(guān)物質(zhì)HPLC法檢測

在有關(guān)物質(zhì)富集、純化及精制過程中采用HPLC方法對STS樣品組成及含量進(jìn)行全程檢測。采用Agilent Extend C18柱（4.6 mm×150 mm，5 mm），上樣體積20 ml，流速為1 ml/min，柱溫為25 ℃，檢測波長為271 nm。

2 結(jié)果

2.1 STS原料與STS精制液的有關(guān)物質(zhì)組成

STS原料HPLC檢測結(jié)果表明，其原料中總雜質(zhì)含量約為5%左右，主要包含了6種有關(guān)物質(zhì)（編號1～6），其保留時間分別為13.122 min，13.474 min，15.576 min，17.139 min，19.196 min及19.433 min（圖1）。

為分析鑒定6種主要有關(guān)物質(zhì)，減少其他雜質(zhì)的干擾，選用STS精制液來進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)富集。結(jié)果表明，STS精制液中含有a和b兩種有關(guān)物質(zhì)，其保留時間為13.495 min和19.122 min（圖2）、含量為15.59%和32.64%，遠(yuǎn)高于STS原料中有關(guān)物質(zhì)含量。由于進(jìn)樣濃度不同相同物質(zhì)出峰時間有微小差異，峰的分離度較好，可判斷為同一種物質(zhì)。

2.2 有關(guān)物質(zhì)的富集與一步純化

經(jīng)過HPLC檢測，STS精制液通過L&L4002;柱進(jìn)行一次富集后，可獲得HPLC純度為53.14%的有關(guān)物質(zhì)樣品a（保留時間13.508 min）和純度為40.89%的有關(guān)物質(zhì)樣品b（保留時間19.261 min）（圖3）。

再經(jīng)過一步純化后，有關(guān)物質(zhì)a和b的純度達(dá)到87.60%和82.58%（圖4）。

2.3 有關(guān)物質(zhì)的二步純化及精制

經(jīng)過二步純化和精制，獲得純度為98.05%的有關(guān)物質(zhì)a和純度為98.60%的有關(guān)物質(zhì)b（圖5）。將制備得到的有關(guān)物質(zhì)a和b樣品中加入STS原料進(jìn)行HPLC圖譜疊加，根據(jù)疊加結(jié)果推測a可能為STS原料中的有關(guān)物質(zhì)2，b可能為有關(guān)物質(zhì)5（圖5）。

2.4 結(jié)構(gòu)鑒定與解析

將上述有關(guān)物質(zhì)2的精制樣品溶液進(jìn)行凍干，得到無定形紅棕色粉末。將該樣品進(jìn)行LC-MS分析，測得其分子離子峰C19H17O7S（[M-Na]-）質(zhì)荷比（m/z）為389.0。進(jìn)一步對樣品進(jìn)行NMR分析，1H-NMR（D2O，400 MHz）數(shù)據(jù)顯示，兩個甲基氫化學(xué)位移信號δH 2.289（3H，s，H-17）和δH 1.241（3H，s，H-18）；兩個苯氫化學(xué)位移信號δH 7.530（1H，J=8.0 Hz，d，H-6）和δH 7.181（1H，J=8.0 Hz，d，H-7）；三個亞甲基氫化學(xué)位移信號δH 2.680-2.730（2H，m，H-1），δH 1.401-1.803（2H，m，H-2）和δH 1.401-1.803（2H，m，H-3）；-CH2OH氫化學(xué)位移信號δH 3.443-3.678（2H，m，H-19），結(jié)合13C-NMR （D2O，100 MHz）δC：29.3（C-1），17.8（C-2），30.8（C-3），39.4（C-4），146.6（C-5），134.7（C-6），121.4（C-7），125.4（C-8），125.0（C-9），149.7（C-10），181.3（C-11），174.5（C-12），119.2（C-13），160.2（C-14），120.5（C-15），147.4（C-16），8.6（C-17），25.5（C-18），69.5（C-19），最終推測其為丹參酮ⅡB磺酸鈉（圖6）。

將上述有關(guān)物質(zhì)4的精制樣品溶液進(jìn)行凍干，得到無定形棕褐色粉末。將該樣品進(jìn)行LC-MS分析，測得其分子離子峰C18H11O6S（[M-Na]-）質(zhì)荷比（m/z）為355.026 5。進(jìn)一步對樣品進(jìn)行NMR分析，1H-NMR（D3COD，400 MHz）數(shù)據(jù)顯示，兩個甲基氫化學(xué)位移信號δH 2.49（3H，s，H-17），δH 2.71（3H，s，H-19），五個苯氫化學(xué)位移信號δH 9.260（1H，J=8.8 Hz，d，H-1），δH 7.532-7.572（1H，m，H-2），δH 7.406（1H，J=6.8 Hz，d，H-3），δH 8.478（1H，J=8.8 Hz，d，H-6），δH 8.004（1H，J=8.8 Hz，d，H-7）。結(jié)合13C-NMR（D2O，100 MHz）δC：63.1（C-1），26.4（C-2），30.1（C-3），34.5（C-4），141.1（C-5），136.0（C-6），123.1（C-7），126.3（C-8），126.3（C-9），149.7（C-10），182.3（C-11），175.2（C-12），119.4（C-13），160.6（C-14），121.7（C-15），151.4（C-16），8.7（C-17），30.8（C-18），30.9（C-19），最終推測其為丹參酮Ⅰ磺酸鈉（圖6）。

將有關(guān)物質(zhì)5的精制樣品溶液進(jìn)行凍干，得到無定形紅棕色粉末。將該樣品進(jìn)行LC-MS分析，測得其分子離子峰C19H17O7S（[M-Na]-）質(zhì)荷比（m/z）為389.0。進(jìn)一步對樣品進(jìn)行NMR分析，1H-NMR（D2O，400 MHz）數(shù)據(jù)顯示，兩個甲基氫化學(xué)位移信號δH 1.218（3H，s，H-18）和δH 1.218（3H，s，H-19）分別是18、19位上的甲基信號，符合紫丹參甲素結(jié)構(gòu)，差異在于15位H信號消失，說明15位為磺化反應(yīng)位置；兩個苯氫化學(xué)位移信號δH 7.618（1H，J=8.2 Hz，d，H-6）和δH 7.266（1H，J=8.0 Hz，d，H-7）；三個亞甲基氫化學(xué)位移信號δH 2.719（2H，J=6.0 Hz，t，H-1），δH 1.530-1.635（2H，m，H-2）和δH 1.530-1.635（2H，m，H-3）說明了其具有萘醌并呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)骨架；-CH2OH氫化學(xué)位移信號δH 4.789（2H，s，H-17），結(jié)合13CNMR（D2O，100 MHz），δC：29.5（C-1），18.3（C-2），36.8（C-3），34.3（C-4），145.5（C-5），134.7（C-6），122.7（C-7），125.3（C-8），125.0（C-9），150.7（C-10），181.5（C-11），174.6（C-12），118.3（C-13），161.4（C-14），120.9（C-15），152.2（C-16），30.7（C-17），30.8（C-18），52.7（C-19），最終推測其為紫丹參甲素磺酸鈉（圖6）。

3 討論

由于丹參酮ⅡA是從丹參藥材飲片中提取，難免混有較低含量的與有效成分相似的結(jié)構(gòu)類似物被引入合成工藝的磺化反應(yīng)過程中，產(chǎn)生副反應(yīng)產(chǎn)物；在精制過程重結(jié)晶時的共結(jié)晶沉淀以及STS原料制備和保存過程中的降解反應(yīng)等都有可能是有關(guān)物質(zhì)的來源。本研究鑒定了丹參酮ⅡA磺酸鈉雜質(zhì)中的3種主要有關(guān)物質(zhì)，并提供了有關(guān)物質(zhì)的制備方法，該方法制備能力強，效率高，工藝操作連續(xù)性強，易于進(jìn)行質(zhì)量控制和生產(chǎn)，可作為丹參酮ⅡA磺酸鈉對照品的生產(chǎn)工藝進(jìn)行大規(guī)模制備。由于方法及儀器限制，未鑒定出STS原料中其他3種主要有關(guān)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，尚需進(jìn)一步開展研究。

致謝：感謝洪勇、廖思懿、霍建麗對本文的貢獻(xiàn)。

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