魏梅，王曉雨，杜建群，林鵬

喉癌是一類常見惡性腫瘤［1］，探究喉癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，積極診治對保留喉發(fā)聲及其他功能具有重要作用。微小RNA（microRNA，miRNA）是真核細(xì)胞中一類非編碼小RNA，可通過調(diào)控多個(gè)靶基因影響胚胎發(fā)育［2］及腫瘤［3］等疾病進(jìn)展。目前，雖有miR-126影響胃癌［4］、肺癌［5］等腫瘤進(jìn)程的報(bào)道，但鮮見其對喉癌影響的綜合研究。本文通過對腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫的分析，系統(tǒng)了解miR-126通過哪些靶基因影響男性喉癌患者的進(jìn)展，并對靶基因基因本體論和參與的信號通路進(jìn)行分析，旨在為喉癌的治療提供新的靶點(diǎn)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料 喉癌患者相關(guān)TCGA數(shù)據(jù)（更新時(shí)間2017年11月27日）由UCSC Xena（https://xenabrowser.net/datapages/）下載，根據(jù)性別、年齡、總生存率（overall survival，OS）、腫瘤分級、臨床分期以及miRNA和mRNA表達(dá)量數(shù)據(jù)的完整性篩選得到97例男性喉癌患者數(shù)據(jù)。根據(jù)TCGA編號末尾數(shù)發(fā)現(xiàn)其中10例患者不僅具有腫瘤組織表達(dá)量，同時(shí)具有癌旁miR-126表達(dá)數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)整理為10對患者miR-126癌與癌旁配對表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.2 分組 根據(jù)miR-126表達(dá)水平的平均值將患者分為低表達(dá)和高表達(dá)組；根據(jù)年齡平均值分為低齡組和高齡組；腫瘤分級G1和G2為低分級組，G3和G4為高分級組；臨床分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期為低級別組，Ⅳ期為高級別組。

1.3 miR-126有效靶基因的分析 通過檢索miRWalk 2.0數(shù)據(jù)庫（http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/）得到已驗(yàn)證的與miR-126相互作用的靶基因，并在TCGA數(shù)據(jù)庫中找出相應(yīng)靶基因mRNA表達(dá)量值，根據(jù)各組基因表達(dá)量的平均值將其分為相應(yīng)基因的低表達(dá)量組和高表達(dá)量組，若Kaplan-Meier（K-M）法分析發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量與喉癌患者總生存率有關(guān)，則認(rèn)為該基因是miR-126影響男性喉癌生存的有效靶基因。

1.4 富集分析方法 將有效靶基因作為gene list提交到DAVID預(yù)測分析網(wǎng)站（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp），其余參數(shù)均選擇默認(rèn)，轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的基因號提交分析系統(tǒng)，選擇物種為“Homo sapiens”，對有效靶基因進(jìn)行基因本體（GO）注釋和京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路進(jìn)行富集分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用IBM SPSS Statistics 19.0、GraphPad Prism 7、Excel 2013對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示；采用K-M法分析相應(yīng)基因表達(dá)量與OS間的關(guān)系；男性喉癌患者預(yù)后影響因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型；配對的癌與癌旁miR-126表達(dá)量差異分析采用配對樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 喉癌患者數(shù)據(jù)基本信息 97例男性喉癌患者年齡38～83歲，平均（62.2±9.0）歲，以年齡平均數(shù)62.2歲為界限分為低年齡組（≤62.2歲，51例）和高年齡組（＞62.2歲，51例）；miR-126平均表達(dá)量為10.964±0.906，以平均值為界限分為低表達(dá)（49例）和高表達(dá)組（48例）；腫瘤低分級組有62例，高分級組有31例，4例分級不確定；臨床分期低級別組33例，高級別組60例，4例未確定分級。

2.2 miR-126是男性喉癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素 K-M法分析發(fā)現(xiàn)，miR-126對男性喉癌患者總生存率影響明顯（P=0.001），高表達(dá)組的預(yù)后明顯優(yōu)于低表達(dá)組，miR-126高表達(dá)有利于延長男性喉癌患者的生存時(shí)間（圖1）。聯(lián)合考慮患者的年齡、腫瘤分級、臨床分級以及miR-126表達(dá)量，進(jìn)行多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析。結(jié)果顯示，miR-126是男性喉癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素，見表1。

Fig.1 KM plot of miR-126 expression and overall survival rate in patients with laryngeal cancer圖1 喉癌患者miR-126表達(dá)量與總生存率間關(guān)系函數(shù)圖

Tab.1 Multivariate Cox proportional hazard analysis of patients with laryngeal cancer表1 喉癌患者多因素Cox回歸分析

具有癌與癌旁miR-126表達(dá)量的10例患者中，miR-126在癌組織的平均表達(dá)量為10.170±0.811，而在癌旁正常組織的平均表達(dá)量為11.059±0.612，miR-126在腫瘤中的表達(dá)量低于癌旁正常組織（t=3.098，P=0.013），這進(jìn)一步說明miR-126能夠抑制腫瘤的發(fā)展。

2.3 miR-126靶基因的預(yù)測 通過miRWalk2.0數(shù)據(jù)庫檢索miR-126的靶基因，發(fā)現(xiàn)該miRNA有L2HGDH、GRIN2B、NFKBIA、KRAS、SIRT1、CRK等58個(gè)靶基因，這些靶基因已在一種或多種實(shí)驗(yàn)方法中得到驗(yàn)證，這些實(shí)驗(yàn)方法包括紫外交聯(lián)免疫沉淀結(jié)合高通量測序、報(bào)告基因檢測、免疫組化、逆轉(zhuǎn)錄PCR、蛋白印跡檢測等。見表2。

2.4 miR-126靶基因在喉癌患者中的表達(dá)差異分析 通過K-M法分析發(fā)現(xiàn)，58個(gè)靶基因中7個(gè)基因的不同表達(dá)水平對喉癌患者的生存具有一定的影響（P＜ 0.05），這7個(gè)有效靶基因?yàn)镈NMT1、GRIN2B、L2HGDH、PIK3R2、PTPN7、SIRT1、TWF1。TWF1基因低表達(dá)患者生存期較長，而其他基因高表達(dá)者生存期較長，見圖2。

Tab.2 The information of miR-126 target genes表2 miR-126靶基因信息

2.5 miR-126有效靶基因GO注釋分析 GO注釋分析結(jié)果顯示，靶基因DNMT1、SIRT1參與了異染色質(zhì)的組成，異染色質(zhì)的出現(xiàn)往往會降低基因的轉(zhuǎn)錄活性，miR-126可以通過參與基因結(jié)構(gòu)的調(diào)控影響細(xì)胞活動。分子功能方面，靶基因?qū)Υ呋磻?yīng)和轉(zhuǎn)移酶的激活具有影響。50%以上的有效靶基因參與的生物學(xué)過程達(dá)到了9個(gè)，其中所有有效靶基因均參與的過程為細(xì)胞大分子的代謝過程，細(xì)胞代謝產(chǎn)生的能量及小分子物質(zhì)對細(xì)胞的正常生長及病變均有重要的作用。另外一大部分有效靶基因還參與大分子修飾、磷酸化調(diào)控等過程。見表3。因此miR-126既能通過影響喉癌細(xì)胞中染色體的轉(zhuǎn)錄活性，也可通過調(diào)控癌細(xì)胞中能量的代謝過程來影響喉癌患者的病程。

2.6 miR-126有效靶基因KEGG通路分析 有效靶基因KEGG通路富集結(jié)果顯示，GRIN2B和SIRT1參與了Amphetamine addiction通路，對其藥物的代謝存在影響。PIK3R2、SIRT1參與了AMPK信號通路和FoxO信號通路。AMPK通路作為一個(gè)能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵通路，影響整個(gè)細(xì)胞的生命活動，能量代謝的失控可能會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展，F(xiàn)oxO信號通路的改變會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、葡萄糖代謝等過程失控。

3 討論

Fig.2 KM plot of effective target gene expression and overall survival rate in patients with laryngeal cancer圖2 喉癌患者有效靶基因不同表達(dá)量患者的總生存曲線圖

miRNA作為一種重要的轉(zhuǎn)錄后修飾方式，對基因的表達(dá)具有重要的作用，因此探究miRNA調(diào)控腫瘤的研究越來越多，miRNA通常會調(diào)控多種靶基因的表達(dá)，靶基因綜合作用的結(jié)果導(dǎo)致其對腫瘤的影響，然而大量研究往往只針對miRNA的一個(gè)或一類靶基因，因此綜合分析所有靶基因?qū)ρ芯縨iRNA的作用具有重要意義。

3.1 miR-126高表達(dá)利于延長男性喉癌患者生存時(shí)間 本研究顯示，miR-126高表達(dá)男性喉癌患者總生存率明顯提高，且在癌旁的正常組織中的表達(dá)量明顯高于癌組織，與在前列腺癌［6］和肺癌［7］中的研究結(jié)果一致。本文首次通過TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)對miR-126對男性喉癌的影響展開研究，為進(jìn)一步研究提供了數(shù)據(jù)支持。

3.2 miR-126通過7個(gè)靶基因影響男性喉癌的進(jìn)展 雖然已有文獻(xiàn)對miR-126的所有靶基因及其在人體正常器官中的功能進(jìn)行過分析［8］，但它在喉癌中的作用尚鮮見研究。本文通過對靶基因?qū)δ行院戆┗颊呱嬗绊懙姆治?，發(fā)現(xiàn)58個(gè)靶基因中有7個(gè)基因?qū)δ行院戆┗颊叩纳嬗兄匾挠绊憽?個(gè)基因中DNMT1［9］和SIRT1［10］已在喉癌研究中報(bào)道，其他5個(gè)基因是我們通過數(shù)據(jù)分析后新發(fā)現(xiàn)的影響男性喉癌患者生存的因素，這為在分子機(jī)制方面研究喉癌進(jìn)展提供了新的思路。

3.3 有效靶基因功能分析 通過對有效靶基因的分析可以深入了解靶基因在細(xì)胞中的作用，為分析miR-126對腫瘤患者的影響提供更多的研究方向。GO富集從參與的生物學(xué)過程、細(xì)胞組分及分子功能方面分析發(fā)現(xiàn)有效靶基因DNMT1、SIRT1可以通過參與異染色質(zhì)的出現(xiàn)，進(jìn)而對相應(yīng)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控來影響腫瘤發(fā)展［11］。分子功能方面，大部分有效靶基因?qū)Υ呋磻?yīng)和轉(zhuǎn)移酶的激活具有影響。細(xì)胞代謝、大分子修飾等9個(gè)生物學(xué)過程參與的有效靶基因達(dá)到一半以上，其中所有有效靶基因均參與了細(xì)胞大分子的代謝過程，細(xì)胞能量代謝的異常以及中間產(chǎn)物非正常的積累往往會導(dǎo)致細(xì)胞分化增殖的失調(diào)，進(jìn)而會引發(fā)腫瘤的發(fā)生［12-13］。另外，大分子修飾、磷酸化等過程也會影響腫瘤進(jìn)程。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，PIK3R2、SIRT1參與的AMPK信號通路和FoxO信號通路正是能量代謝與細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號通路［14］，AMPK是FoxO信號通路上游的重要分子［15］，兩者共同作用可以調(diào)控細(xì)胞周期、凋亡等過程，進(jìn)而會影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

Tab.3 GO enrichment analysis of miR-126 effective target gene表3 miR-126有效靶基因的GO富集分析

Tab.4 Signal pathway enrichment analysis of miR-126 target gene表4 MiR-126靶基因信號通路富集分析

綜上，本研究分析發(fā)現(xiàn)，miR-126通過DNMT1、GRIN2B、L2HGDH、PIK3R2、PTPN7、SIRT1、TWF1這7個(gè)靶基因調(diào)節(jié)代謝和細(xì)胞凋亡等過程，進(jìn)而延長男性喉癌患者的總生存率，通過本文的分析，可以使我們通過能量代謝途徑分析研究miR-126與男性喉癌進(jìn)展的關(guān)系，為進(jìn)一步研究提供了理論支持。