樸怡情，申屠旭萍，葉子弘

(中國計量大學(xué)，浙江省生物計量及檢驗檢疫技術(shù)重點實驗室，浙江 杭州 310018)

木霉素是單端孢霉烯類化合物的一種，可抑制真核生物細胞核糖體的轉(zhuǎn)肽酶，從而影響蛋白質(zhì)的合成以及遺傳信息的傳遞，因而是一種蛋白質(zhì)合成抑制劑[1,2]。同時，木霉素還能抑制多種植物病原真菌，具有廣闊的生防應(yīng)用前景[3-5]。有關(guān)木霉素在醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用，國外早在20世紀70年代就有相關(guān)報道[1]，國內(nèi)相關(guān)木霉素的研究報道主要集中在對農(nóng)作物病原真菌的生物防治[4]。

目前國內(nèi)外未見木霉素標準樣品研制的報道，也無木霉素標準樣品可以購買，使得相關(guān)木霉素的深入研究和開發(fā)受到了極大的限制。為此，全國標準樣品技術(shù)委員會批準了木霉素國家標準樣品的研制。我們參照ISO Guide 35:2017，依據(jù)GB/T15000.3-2008標準樣品系列工作導(dǎo)則[6]，研制了木霉素的國家標準樣品。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Buchi)，氣相色譜儀(Agilent GC-6890)，HYG-B恒溫搖床(太倉市實驗儀器廠)，TDL-5-A離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)，WFH-203B型暗箱式紫外透射儀(上海精科實業(yè)有限公司)，AB204-N電子天平(瑞士梅特勒公司)。乙酸乙酯和正丁醇等有機溶劑，均為分析純試劑(杭州常青化工有限公司)；乙酸乙酯(GC檢測用，色譜純)，硅膠100-200目(青島海洋化工廠)，GF254硅膠板(山東煙臺匯友硅膠有限公司)。

1.2 木霉素樣品的制備

以臍孢木霉菌(Trichodermabrevicompactum)發(fā)酵代謝產(chǎn)物為原料，分別經(jīng)乙酸乙酯和正丁醇溶劑提取后濃縮干燥獲得粗品，采用硅膠柱層析多次分離純化獲得純度不低于99%的木霉素純品。其中臍孢木霉菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物獲得采用搖瓶發(fā)酵法收集：在250 mL三角瓶中裝量60 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基(20 g/L葡萄糖，5 g/L蛋白胨，1 g/L牛肉浸膏，0.001 g/L ZnSO4·7H2O和0.01 g/L NH4Cl)，滅菌，待冷卻后每培養(yǎng)瓶接種1 mL臍孢木霉菌孢子懸液(含孢子為106個/mL)，置于恒溫搖床上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28 ℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，培養(yǎng)時間3 d。發(fā)酵液在5000 r/min下離心10 min，取上清液備用。多批次發(fā)酵，合并收集代謝產(chǎn)物約80 L，濃縮、干燥后供后續(xù)分離。

1.3 定性分析

采用紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、質(zhì)譜(MS)和核磁共振(NMR)對所制備的木霉素進行結(jié)構(gòu)確認。

1.4 定值分析

1.4.1 GC色譜條件

儀器：Agilent 6890氣相色譜儀；色譜柱：HP-5彈性石英毛細管柱(以5%苯基甲基硅氧烷為固定液，30 m×320 μm×0.25 μm)；檢測器：氫火焰離子檢測器(FID)，檢測器溫度270 ℃；進樣口溫度250 ℃；柱溫度：程序升溫，初始溫度100 ℃，保持5 min，以10 ℃/min升溫至260 ℃保持5 min；載氣：氮氣；流速1.5 mL/min；不分流，以乙酸乙酯為溶劑[7]。

1.4.2 GC-TOF分析條件

儀器：質(zhì)譜分析采用GCT-Premier GC-TOF質(zhì)譜儀(Waters公司)測定，GC條件同1.4.1。質(zhì)譜條件：電離方式為EI，電離能量為70 eV，離子源溫度為280 ℃，接口溫度為280 ℃，掃描范圍m/z 5-560 amu。

1.4.3 樣品溶液制備

稱取木霉素樣品，用乙酸乙酯色譜純?nèi)芙猓|(zhì)量濃度在400～2 000 μg/mL范圍內(nèi)，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.5 均勻性檢驗

對同一批制備的木霉素樣品進行分裝，按照標準樣品工作導(dǎo)則[6]第7章均勻性研究的要求進行。抽樣數(shù)目為12個，按3種程序分別從每瓶中稱取1.0 mg樣品3份，每份樣品加色譜純乙酸乙酯溶解，GC法檢測木霉素純度。3次的抽樣順序為1，3，5，7，9，11，2，4，6，8，10，12號瓶；12，11，10，9，8，7，6，5，4，3，2，1號瓶；2，4，6，8，10，12，1，3，5，7，9，11號瓶。按照1.4.1項GC色譜條件對每個樣品重復(fù)測定3次。用方差分析法對檢測數(shù)據(jù)進行分析，以判斷標準樣品是否均勻。

1.6 穩(wěn)定性檢驗

本研究通過檢測木霉素樣品純度的變化來研究其穩(wěn)定性，以便確定有效期。樣品分裝后，于-20～-18 ℃保存。本研究以一年為期，對制備的木霉素樣品取樣檢驗，每份試樣以測定3次的平均值為其定值結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 木霉素的結(jié)構(gòu)鑒定

2.1.1 元素分析

根據(jù)JY/T 017-1996元素分析儀方法通則進行測試。分子式為C17H24O4，計算值：C 69.84%，H 8.27%，O 21.89%。實際測定值：C 69.88%，H 8.27%，O 21.91%。

2.1.2 紫外(UV)光譜分析

溶劑為CH3OH，紫外可見光區(qū)(200～800 nm)全波長掃描，在205 nm處有吸收。

2.1.3 紅外(IR)光譜分析

溴化鉀壓片，紅外光譜(IR，cm-1)：2 969.21-CH3反對稱伸縮，2 839.02-CH伸縮，1 732.92-酯鍵伸縮，1 243.04-羥基碳和甲基C-C伸縮。

2.1.4 高分辨率質(zhì)譜(MS)分析

質(zhì)譜條件：電離方式為EI，電離能量為70 eV，離子源溫度為280 ℃，接口溫度為280 ℃，掃描范圍m/z 5～560 amu。測得木霉素相對分子質(zhì)量為292.167 0。

2.1.5 核磁共振(NMR)分析

以氘代氯仿為溶劑，四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標，核磁數(shù)據(jù)歸屬見表1。

表1 木霉素的核磁共振數(shù)據(jù)

將木霉素的MS和NMR數(shù)據(jù)與文獻報道的進行比對，基本一致[5,8,9]，確定該化合物為木霉素，結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 木霉素結(jié)構(gòu)式

2.2 純度分析

2.2.1 GC純度分析

參照1.4.1GC分析條件，對木霉素樣品進行純度分析，結(jié)果見圖2?？鄢軇┥V峰后，對樣品色譜峰進行面積歸一法定量，經(jīng)積分，木霉素純度為99.82%。

圖2 木霉素GC圖

2.2.2 GC-TOF純度分析

參照1.4.2 GC-TOF分析條件，對木霉素樣品進行純度分析，結(jié)果見圖3。從該圖可知為單一峰，說明木霉素純度較高。

圖3 木霉素GC-TOF圖

2.3 均勻性試驗

將木霉素樣品進行分裝后，對其進行純度均勻性檢驗，檢測結(jié)果見表2、表3。

表2 木霉素標準品純度均勻性檢驗結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

從表3可見，以υ1(即組間)=11及υ2(即組內(nèi))=24，F(xiàn)=MS間/MS內(nèi)=1.42

均勻性檢驗的不確定度ubb=sbb=0.003 706。

2.4 穩(wěn)定性試驗

木霉素樣品在-20～-18 ℃條件下保存，分別于0，1，2，3，6，9，12個月時各取3個樣品進行穩(wěn)定性檢驗，按照1.4.1項色譜條件，每份樣品連續(xù)進樣3次，用峰面積歸一化法求出純度，結(jié)果見表4。

從上表4數(shù)據(jù)看，測得的木霉素純度平均值在測定時間內(nèi)隨時間的變化不明顯，同時根據(jù)GB/T 15000-2008標準樣品工作導(dǎo)則(3)《標準樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法》的要求，以直線模型作為經(jīng)驗?zāi)Ｐ停謩e采用t檢驗和F檢驗分析穩(wěn)定性檢驗獲得的數(shù)據(jù)。具體計算如下：

表4 穩(wěn)定性檢驗試驗結(jié)果

t檢驗斜率計算

直線的截距

直線上的點的標準偏差

取其平方根s=0.009 07，與斜率相關(guān)的不確定度

自由度為n-2和p=0.95(95%置信水平)的分布t因子等于2.571。

由于

|b1|

所以，斜率變化不顯著。因而木霉素樣品在一年內(nèi)是穩(wěn)定的。

有效期t=12個月的長期穩(wěn)定性的不確定度為

u=sb×t=0.000 830 2×12=0.009 962。

擴展不確定度u1st=2u=0.009 962×2=0.019 924。

F檢驗：上表數(shù)據(jù)(0～12個月)經(jīng)線性擬合，結(jié)果見表5。

表5 線性回歸方差分析表

線性回歸方差分析：從表5的數(shù)據(jù)可以看出，在測定時間范圍內(nèi)(12個月)直線回歸方程的擬合度較好。經(jīng)直線回歸的方差分析得到F=2.29小于方差分析臨界值F0.05(1,5)=6.61。

由此確定木霉素樣品在-20～-18 ℃保存條件下，至少在12個月內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.5 定值結(jié)果及其不確定度評定

2.5.1 定值結(jié)果

木霉素標準樣品定值的方法根據(jù)GB/T 15000-2008《標準樣品工作導(dǎo)則(3)標準樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法》規(guī)定，選擇多個實驗室采用一種方法協(xié)作進行測定。為此我們隨機抽取16瓶樣品，分別向獲得國家或部門認可的具備資質(zhì)的8家實驗室送樣，每個定值實驗室送2瓶，每瓶平行測定3次。定值實驗室將樣品配成一定濃度的溶液，氣相色譜法測定，采用峰面積歸一化法進行純度定值。木霉素純度定值結(jié)果匯總表如表6所示。

表6 8家實驗室木霉素純度定值數(shù)據(jù)

表7 8家實驗室定值數(shù)據(jù)方差分析

Table 7 Analysis of variance of 8 laboratory certification data

變差源SS自由度MS組間0.007470.00106組內(nèi)0.0104400.00026總和0.017847

2.5.2 定值分析的不確定度評定

標準樣品特性標準值的測量不確定度u分別由聯(lián)合定值實驗引入的不確定度uchar、均勻性檢驗引入的不確定度ubb和穩(wěn)定性檢驗引入的不確定度ults3部分組成。結(jié)合實際研究結(jié)果，木霉素標準樣品的特性標準值和不確定度計算如下。

2)均勻性檢驗引入的不確定度ubb=0.003 7%。

3)穩(wěn)定性檢驗引入的不確定度ults=1.99%。

標準樣品定值結(jié)果的不確定度

擴展不確定度

=0.041 6%。

木霉素標準樣品的定值結(jié)果：木霉素樣品的純度為99.86%，擴展不確定度根據(jù)只進不舍的原則統(tǒng)一小數(shù)點位數(shù)后為0.05%。

3 結(jié) 語

按照標準樣品工作導(dǎo)則[6]的要求，研制的木霉素標準樣品經(jīng)均勻性檢驗、穩(wěn)定性檢驗，均符合要求，定值結(jié)果為(99.86±0.05)%，達到了天然產(chǎn)物國家標準樣品的要求。該標準樣品可用于木霉素含量測定、檢測方法評定、相關(guān)產(chǎn)品的檢測與質(zhì)量控制等。