林 君，曹 利

(1.重慶市第七人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400054；2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院，重慶 400038)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，簡(jiǎn)稱金葡菌)是一種重要的人獸共患病原菌，常引起人皮膚軟組織感染、肺炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥，動(dòng)物乳房炎等疾病，死亡率高[1]。金葡菌的播散主要以特定的克隆群傳播為主。檢測(cè)和明確特定區(qū)域的金葡菌主要流行克隆及其菌株的耐藥水平，對(duì)切斷其傳播途徑，終止耐藥金葡菌感染具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

按菌株耐藥性的差異，金葡菌通常分為耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)，這兩者的主要區(qū)別在于前者染色體中攜帶一葡萄球菌盒式染色體(SCCmec)，其中的耐藥基因mecA可編碼對(duì)甲氧西林等β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的決定簇PBP2a，介導(dǎo)MRSA的耐藥性[1-2]。多種分子分型技術(shù)，如多位點(diǎn)序列分析(MLST)、葡萄球菌A蛋白(spa)基因分型以及附屬基因調(diào)節(jié)子(agr)分型等已被廣泛應(yīng)用于MRSA的進(jìn)化和流行病學(xué)研究[3]。研究證實(shí)，ST5、ST239和ST8是世界范圍內(nèi)流行的主要MRSA克隆群[4]。在我國(guó)，MRSA分離率雖因地區(qū)不同而有較大差異，總體上約占金葡菌感染的60%左右，ST239、ST5和ST59也是我國(guó)MRSA優(yōu)勢(shì)流行克隆[4]；MSSA在我國(guó)占金葡菌感染的40%左右，但目前對(duì)MSSA的研究報(bào)道較少。相對(duì)于MRSA而言，通常認(rèn)為MSSA不存在優(yōu)勢(shì)克隆，而表現(xiàn)出更高的遺傳多樣性及更高的毒力因子表達(dá)[5]，并且與菌血癥、心內(nèi)膜炎以及敗血癥關(guān)聯(lián)更密切[6]。在MRSA和MSSA的菌株進(jìn)化分析中發(fā)現(xiàn)，MSSA獲得SCCmec遺傳元件是MRSA的重要來(lái)源，MSSA可作為MRSA毒力因子的資源庫(kù)。葡萄球菌殺白細(xì)胞毒素(pvl)是金葡菌重要的毒力因子，在金葡菌感染中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7]。流行病學(xué)研究證實(shí)，ST8、ST59、ST121、ST398是主要的攜帶pvl基因的克隆[8]。

分子分型是金葡菌分子型別確定的重要方法，筆者采用多種金葡菌分子分型方法，結(jié)合pvl毒力基因檢測(cè)和耐藥譜分析，對(duì)2013年6月至2014年12月從重慶西南醫(yī)院分離的110株金葡菌進(jìn)行了分子型別檢測(cè)研究，一方面從一定程度上揭示了重慶地區(qū)金葡菌的流行特征和耐藥狀態(tài)，另一方面也為我國(guó)其他地區(qū)金葡菌感染和流行的檢測(cè)分析提供了參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來(lái)源 110株金葡菌分離自重慶西南醫(yī)院，主要源自2013年6月至2014年12月期間110位住院患者的痰液、膿液、血液、穿刺液、分泌物等標(biāo)本。

1.1.2儀器與試劑 PCR儀、垂直電泳儀、凝膠成像儀為Bio-Rad設(shè)備，Bio-Fosum微生物鑒定藥敏分析儀為上海復(fù)星佰珞公司產(chǎn)品;TSB、BHI培養(yǎng)基為OXOID產(chǎn)品。

1.1.3引物 金葡菌分子分型及pvl毒力基因檢測(cè)引物均參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)[9-14]，由華大基因合成。具體引物序列見表1。

表1 分子分型及毒力基因檢測(cè)所用引物序列及擴(kuò)增大小

續(xù)表1 分子分型及毒力基因檢測(cè)所用引物序列及擴(kuò)增大小

1.2方法

1.2.1細(xì)菌培養(yǎng)、基因組提取及菌株鑒定 細(xì)菌的分離培養(yǎng)按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行，基因組提取參照文獻(xiàn)[9]所述方法進(jìn)行。金葡菌及MRSA、MSSA的鑒定通過(guò)PCR方法分別檢測(cè)金葡菌分離菌株的mecA與femB基因[9]。若femB基因?yàn)殛?yáng)性，mecA基因?yàn)殛幮耘袛酁镸SSA菌；mecA與femB基因皆陽(yáng)性者，判為MRSA菌。

1.2.2spa分型 用特異性引物通過(guò)PCR擴(kuò)增出金葡菌spa基因的X區(qū)[10]，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，將獲得的序列提交spa基因分型數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ridom.de/spaserver)，參照已公布的重復(fù)序列，根據(jù)重復(fù)序列出現(xiàn)的次數(shù)和排列方式確定型別[26]。

1.2.3MLST分型 分別擴(kuò)增金葡菌7個(gè)管家基因(arcc、aroe、glp、gmk、pta、tpi、yqil)序列，產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序，所獲序列提交MLST數(shù)據(jù)庫(kù)(http://saureus.mlst.net/)進(jìn)行分析得出其MLST型別，即序列型(ST)[11]。

1.2.4MRSA菌株的SCCmec分型 根據(jù)文獻(xiàn)[12]所述方法，通過(guò)PCR方法進(jìn)行金葡菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ型的SCCmec分型。

1.2.5MSSA菌株的agr分型 參照文獻(xiàn)[13]所述方法，通過(guò)多重PCR擴(kuò)增MSSA菌株基因組，PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，441、575、323、和659 bp大小的條帶分別代表agr Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、和Ⅳ型。

1.2.6pvl毒力基因及耐藥基因檢測(cè) 通過(guò)PCR方法，用特異性引物擴(kuò)增所有金葡菌的pvl基因[14]，判斷菌株的毒力基因攜帶情況。

1.2.7藥敏試驗(yàn) 用Bio-Fosum微生物鑒定藥敏分析儀(上海復(fù)星佰珞公司) 對(duì)菌株的耐藥情況進(jìn)行測(cè)定，按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI) 2015年出版的瓊脂稀釋法藥敏試驗(yàn)解釋標(biāo)準(zhǔn)判斷菌株對(duì)抗菌藥物的耐藥狀態(tài)[15]，以耐藥(R)、敏感(S)表示。

1.2.8多重耐藥菌的判定 按照文獻(xiàn)[16]，某株金葡菌如果對(duì)至少3類抗菌藥物耐藥(每類抗菌藥物中至少有一種代表藥物耐藥)，則定義該菌株為多重耐藥(MDR)菌株。

2 結(jié) 果

2.1MRSA與MSSA鑒定 110株臨床金葡菌經(jīng)PCR擴(kuò)增mecA和femB基因檢出MRSA菌株59株，占53.6%，MSSA菌株51株，占46.4%。

2.2分子分型

2.2.1spa分型 對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，110株金葡菌株可分為38種spa基因型(表2)。其中59株MRSA分為11種spa基因型，優(yōu)勢(shì)型別為t037(28.8%，17/59),t437(27.1%，16/59)，t138(16.9%,10/59)和t030(11.9%,7/59)；51株MSSA分為27種spa基因型，主要型別有t7146(13.7%,7/51)，t3297(7.8%,4/51)和t189(5.9%,3/51)。另外有9株MSSA菌未能分型，可能為新的spa型別。

2.2.2MLST分型 110株金葡菌可分為26種ST型(表2)。在59株MRSA中，優(yōu)勢(shì)型別為ST239(57.6%,34/59)和ST59(28.8%,17/59)，另外發(fā)現(xiàn)1株不能分型，可能為新的ST型；51株MSSA分為18種ST型，主要型別有ST7(19.6%，10/51)，ST15(11.8%,6/51)，ST25(7.8%,4/51)，ST1188(7.8%,4/51)，ST398(7.8%,4/51)，ST5(5.9%,3/51)、ST464 (5.9%,3/51)和ST943(5.9%,3/51)。

2.2.3MRSA菌株的SCCmec分型 經(jīng)多重PCR擴(kuò)增，59株MRSA菌株檢出SCCmec Ⅲ型34株(57.6%)，SCCmec Ⅰ型12株(20.3%)，SCCmec Ⅳ型7株(11.9%)，SCCmec Ⅴ型6株(10.2%)，結(jié)果見表2。

2.2.4MSSA菌株的agr分型 將51株MSSA菌株進(jìn)行agr分型，檢測(cè)出agr Ⅰ型35株，占68.6%，agr Ⅱ型9株(17.7%)，agr Ⅲ型4株(7.8%)，agr Ⅳ型3株(5.9%)。見表2。

2.2.5pvl基因檢測(cè) 59株MRSA菌株中，pvl毒力基因檢出率為23.7%(14/59)，14株pvl陽(yáng)性菌株中有8株為ST239型，另6株為ST59型;51株MSSA菌株中有4株為pvl陽(yáng)性(7.8%)，分別為ST1、ST88、ST398和ST938型(表2)。

表2 110株金葡菌的分子特征(括號(hào)內(nèi)為菌株數(shù))

表3 金葡菌臨床分離株抗菌藥物藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.3藥敏試驗(yàn)分析 110株金葡菌對(duì)13種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表3。MRSA對(duì)糖肽類抗菌藥物[萬(wàn)古霉素(VAN)、替考拉寧(TEC)]和唑烷酮類抗菌藥物[利奈唑胺(LZD)]全部敏感，但是對(duì)其余被檢抗菌藥物的耐藥率則較高。相對(duì)于MRSA菌株而言，MSSA菌株對(duì)大多數(shù)抗菌藥物敏感，但對(duì)青霉素(PEN)、紅霉素(ERY)、克林霉素(CLI)、環(huán)丙沙星(CIP)、復(fù)方新諾明(SXT)、慶大霉素(GEN)和四環(huán)素(TET)等均表現(xiàn)出一定的耐藥性。

2.4MDR菌株的耐藥譜及分子特點(diǎn) 所有的MRSA菌株均為MDR菌株，而51株MSSA菌株中有24株為MDR菌株。34株ST239 MRSA菌株有共同的耐藥譜PEN/CIP/GEN/RIF/TET/LEV。24株MSSA多重耐藥菌株中，有12株對(duì)3類抗菌藥物耐藥，其耐藥譜見表4；有50%的MSSA菌株對(duì)3種以上的抗菌藥物耐藥，其中1株對(duì)6類抗菌藥物耐藥(PEN/ERY/CLI/SXT/CIP/TET)，表明敏感菌MSSA中的多重耐藥性也不容忽視。

表4 MSSA多重耐藥菌株株耐藥譜及其分子特點(diǎn)

3 討 論

自20世紀(jì)80年代以來(lái)，MRSA因具有較強(qiáng)的定植能力和外界環(huán)境適應(yīng)能力，在全球范圍內(nèi)迅速傳播，成為醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染的重要病原菌。在我國(guó)，臨床金葡菌中的MRSA檢出率從1980年的20%迅速升高到2008年的約60%[17]，引起了我國(guó)醫(yī)務(wù)工作者的高度關(guān)注。流行病學(xué)研究表明，ST239-MRSA-Ⅲ和ST5-MRSA-Ⅱ是我國(guó)MRSA優(yōu)勢(shì)流行型別[4]。本研究中，來(lái)自重慶地區(qū)的MRSA檢出率為53.6%(59/110)，接近全國(guó)平均水平，該地區(qū)的MRSA優(yōu)勢(shì)流行型別為ST239-MRSA-Ⅲ (57.6%,34/59)和ST59-MRSA-Ⅰ/Ⅳ/Ⅴ(28.8%,17/59)，這一結(jié)果與以往報(bào)道的對(duì)重慶MRSA的分析結(jié)果相一致[4,18]。ST239是亞洲國(guó)家的主要流行克隆[19]，有研究證實(shí)，ST239-MRSA-Ⅲ-t037，是我國(guó)北京地區(qū)2000年之前的主要克隆，之后逐漸被ST239-MRSA-Ⅲ-t030取代[20]，本研究中ST239-MRSA-Ⅲ-t037仍然是最優(yōu)勢(shì)克隆(50.0%,17/34)，而ST239-MRSA-Ⅲ-t030占20.6%(7/34)，表明ST239-MRSA-Ⅲ-t037型菌株在重慶地區(qū)有更強(qiáng)的適應(yīng)能力和傳播能力。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，MRSA菌株全部為多重耐藥菌。

和MRSA相比，MSSA菌株通常擁有更高的遺傳多樣性[21]，在我國(guó)的研究報(bào)道中，主要的MSSA型別因地區(qū)不同而差異較大[20,22]。本研究中鑒定的51株MSSA菌可分為18種ST型別和27種spa型，相對(duì)于MRSA菌株(8種ST型別，11種spa型)而言，MSSA具有更多的克隆多態(tài)性。ST7、ST15、ST25、ST88、ST188、ST398、ST5、ST464和ST943是該地區(qū)主要的MLST型別。ST121是在全球廣泛分布的社區(qū)獲得性克隆群，因其高毒力而引起研究者關(guān)注[23]。我國(guó)對(duì)于ST121金葡菌的報(bào)道較少，在本研究中，有2株MSSA菌株檢測(cè)為ST121型(3.9%，2/51)，此2株菌雖未攜帶pvl毒力基因，但其高毒力特征值得深入研究。

在歐美地區(qū)，臨床分離的MSSA對(duì)除青霉素之外的大多數(shù)常用抗菌藥物敏感[21,24]，因此MSSA的耐藥情況在國(guó)外并未引起關(guān)注。在我國(guó)的報(bào)道中，已發(fā)現(xiàn)MSSA除對(duì)PEN耐藥外，還對(duì)ERY、CLI等存在不同程度的耐藥[25]。在本研究的51株MSSA菌株中檢出了高比例的多重耐藥菌株(47.1%，24/51)，這些MDR菌有不同的耐藥譜，但多數(shù)對(duì)PEN、ERY和CLI耐藥(75.0%，18/24)。在這些MDR型MSSA中，有3株對(duì)五類抗菌藥物耐藥，另外有1株菌株對(duì)6類抗菌藥物耐藥，提示MSSA的耐藥性在重慶地區(qū)不容樂(lè)觀，值得臨床高度關(guān)注。

4 結(jié) 論

本研究在一定程度上揭示了重慶地區(qū)MRSA和MSSA的種群分子特征及耐藥譜，其中MRSA以ST239-MRSA-Ⅲ占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；而MSSA分子型別則呈現(xiàn)出多樣性。ST121等高毒力、多重耐藥菌株的檢出，提示在我國(guó)金葡菌感染的防控中，除關(guān)注MRSA外，MSSA以其較高的毒力以及越來(lái)越嚴(yán)峻的耐藥形勢(shì)同樣需要給予高度關(guān)注。