生乳中硝酸鹽還原菌的篩選及系統(tǒng)發(fā)育分析

王慧敏，王利，粘靖祺

（黑龍江省完達山乳業(yè)股份有限公司，哈爾濱 150078）

硝酸鹽、亞硝酸鹽作為食品護色劑、防腐劑被廣泛應用于腌臘、醬鹵、肉灌腸、發(fā)酵肉制品等食品中，以增強和改善肉制品的色澤，延長保存時間。硝酸鹽在一定條件下可被還原為亞硝酸鹽，但鑒于過量的亞硝酸鹽對人體有一定危害，所以國家對硝酸鹽、亞硝酸鹽使用量和亞硝酸鹽的殘留量都做出了嚴格的限制。硝酸鹽、亞硝酸鹽雖可以作為食品添加劑，但在乳制品中是嚴禁使用的。牛乳中的亞硝酸鹽來源就成為控制的關鍵。我國國家標準對乳粉中的亞硝酸鹽含量做了限量規(guī)定，其含量（以NaNO2計）不得大于2mg/kg[1]。乳制品中亞硝酸鹽的來源有多方面因素，一是自然界廣泛存在這種化合物，因此，哺乳動物的乳汁分泌和形成過程中就已含有此類物質(zhì)；如有研究報道，對6只大鼠舌表面細菌進行計數(shù)、分離、純化，從中發(fā)現(xiàn)4個屬的具有硝酸鹽還原性的優(yōu)勢菌[2]。二是硝酸鹽和亞硝酸鹽的轉(zhuǎn)化。自然界中確實存在一些微生物具有將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽的能力。董競等[3]從侗族酸肉中篩選出9株具有硝酸鹽還原能力的菌株，其中2株硝酸鹽還原能力較高；何燕飛等[4]從浙江省特色腌魚制品中也分離出兩株硝酸鹽還原菌菌株。乳制品中含有豐富的含氮有機物，其在微生物的作用下可逐漸分解成氨，氨可進一步被微生物轉(zhuǎn)化為硝酸鹽和亞硝酸鹽，硝酸鹽在一定條件下亦可還原為亞硝酸鹽。因此，如能有效控制生乳中的相關微生物，對亞硝酸鹽的控制可以起到輔助性作用。

本試驗以生乳中的微生物為研究對象，對生乳中的硝酸鹽還原菌進行了分離、純化，進而進行分子生物學鑒定，以期為控制乳制品生產(chǎn)中由硝酸鹽還原菌引起的質(zhì)量風險提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與培養(yǎng)基

生乳樣品：混合生乳樣品。

PCA培養(yǎng)基[5]：胰蛋白胨5.0g，酵母浸膏2.5g，葡萄糖1.0g，瓊脂15.0g，將上述成分溶于1 000mL蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)值pH至7.0±0.2，分裝于適宜的容器中，121℃高壓滅菌15min。

磷酸鹽緩沖液：磷酸二氫鉀（KH2PO4）34.0g，蒸餾水500mL，pH7.2；貯存液：將34.0gKH2PO4溶于500mL蒸餾水中，用大約175mL的1mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH值，用蒸餾水稀釋至1 000mL后貯存于冰箱；稀釋液：取貯存液1.25mL，用蒸餾水稀釋至1 000mL，分裝于適宜的容器中，121℃高壓滅菌15min。

MPC瓊脂培養(yǎng)基[6]：胰蛋白胨5.0g，酵母浸膏2.5g，葡萄糖1.0g，無抗脫脂奶粉1.0g，將上述成分溶于1 000mL蒸餾水中，用15%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0±0.1。加入瓊脂10～15g，煮沸使瓊脂融化。必要時使用兩層紗布（夾脫脂棉）過濾，分裝于適宜的容器中，121℃高壓滅菌15min。

DTA培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0g，葡萄糖5.0g，2%溴甲酚紫乙醇溶液2mL，將上述成分溶于1 000mL蒸餾水中，用15%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.9±0.1。加入瓊脂10～15g，煮沸使瓊脂融化。分裝于適宜的容器中，121℃高壓滅菌15min。

硝酸鹽還原培養(yǎng)基[7]：蛋白胨1.0g，NaCl 0.5g，KNO30.1～0.2g，pH7.4，分裝于試管中，121℃高壓滅菌15min。

1.2 方法

1.2.1 生乳中微生物的分離

以無菌吸管吸取25mL混合生乳樣品至盛有225mL磷酸緩沖液的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預置適當數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成10-1的樣品勻液。用1mL無菌微量移液器吸取10-1樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL磷酸緩沖液的無菌試管中，振搖試管，制成10-2的樣品勻液，以此方法配制10-1～10-6的稀釋液，每遞增稀釋一次，換用一次無菌微量移液器吸頭。各取1mL均勻涂布于PCA平板中，平行涂布3板；同時，分別吸取1mL磷酸緩沖液加入兩個無菌平板中作為空白對照，36±1℃培養(yǎng)48±2h。

嗜冷菌分離：取各梯度稀釋液1mL均勻涂布于MPC平板中，平行涂布3板；同時，分別吸取1mL磷酸緩沖液加入兩個無菌平板中作為空白對照，于6.5±0.5℃培養(yǎng)10d，培養(yǎng)皿堆疊不超過6個。

需氧芽孢菌分離：將混合生乳樣品經(jīng)80℃加熱處理10min，按上述方法制成10-1～10-6的稀釋液，取各梯度稀釋液1mL均勻涂布于MPC平板中，平行涂布3板；同時，分別吸取1mL磷酸緩沖液加入兩個無菌平板中作為空白對照，36±1℃培養(yǎng)48±2h。

嗜熱芽孢菌分離：將混合生乳樣品經(jīng)100℃加熱處理30min，按上述方法制成10-1至10-6的稀釋液。取各梯度稀釋液1mL均勻涂布于DTA平板中，平行涂布3板；同時，分別吸取1mL磷酸緩沖液加入兩個無菌平板中作為空白對照，55±1℃培養(yǎng)48±2h。

待長出明顯菌落后，從最高稀釋倍數(shù)的平板中挑取單個菌落，以平板劃線的方式多次純化，鏡檢，初篩分離出菌落形態(tài)不同的純化菌株。

1.2.2 硝酸鹽還原菌的篩選

將分離純化的菌株接種于裝有硝酸鹽還原培養(yǎng)基的試管中，每個菌株接種2支并編號，保留2支空白試管作為對照，37±1℃培養(yǎng)48±2h。觀察結果時，在試管中加入幾滴Griess試劑，若出現(xiàn)紅色，則說明具備硝酸鹽還原性；如未變紅，在對應編號的另一支試管中加入鋅粉，搖動，37℃培養(yǎng)30min，加入Griess試劑，出現(xiàn)紅色，證明培養(yǎng)基中的硝酸鹽仍然存在，如不出現(xiàn)紅色，則說明硝酸鹽已被進一步還原。以此方法篩選出具備硝酸鹽還原能力的菌株。

1.2.3 硝酸鹽還原菌的分子生物學鑒定

變性：從培養(yǎng)基中挑取菌體于50μL TaKaRa（寶生物）微生物直接裂解 PCR緩沖液中，變性后離心取上清液作為模板，反應條件80℃，15min。使用TaKaRa（寶生物） 16S rDNA 細菌鑒定 PCR 試劑盒擴增目的片段。取變性反應液1μL，PCR預混液25μL，上、下游引物各0.5μL(20pmol/μL),定容至50μL。反應條件：94℃預變性5min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，循環(huán)30次；72℃終延伸5min。

使用TaKaRa （寶生物）MiniBEST 瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒切膠回收目的片段進行DNA測序，然后在GenBank中比對。

2 結果與分析

2.1 硝酸鹽還原性測試

通過硝酸鹽還原試驗，分離出具備硝酸鹽還原能力的菌株5株，如圖1所示，編號為BA-1、BA-2、BA-3、BA-4和BA-5。

圖1 硝酸鹽還原顯色反應

2.2 分子生物學鑒定

將菌株BA-1、BA-2、BA-3、BA-4、BA-5的PCR產(chǎn)物，各取5μL進行3%瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖2所示。

圖2 3%瓊脂糖凝膠電泳圖

將菌株BA-1、BA-2、BA-3、BA-4、BA-5的16S rDNA測序結果和GenBank已發(fā)布的菌株進行同源性比較，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

系統(tǒng)發(fā)育樹（系統(tǒng)進化樹）是研究生物進化和系統(tǒng)分類中常用的一種樹狀分枝的圖形，樹枝上的數(shù)字表示bootstrap驗證中該樹枝可信度的百分比，用來概括表示各種（類）生物之間的親緣關系。構建系統(tǒng)發(fā)育樹需要做Bootstrap檢驗，一般Bootstrap值大于70，認為構建的進化樹較為可靠。當Bootstrap值過低時，所構建的進化樹其拓撲結構可能存在問題，進化樹不可靠。

通過對鑒定結果進行分析，結果如圖3所示：

圖3 相關菌株序列的16S rDNA基因序列的鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹[原始樹（original tree），結點處數(shù)值為bootstrap值，括號外為序列登錄號]

采用Mega3.1軟件的鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，由系統(tǒng)進化樹（圖3）和序列同源性比對（表1）可知，在系統(tǒng)進化樹上，BA-1、BA-3、BA-4與蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌聚在一起；BA -2與波茨坦短芽孢桿菌聚在一起；BA -5與luciferensis芽孢桿菌聚在一起。

表1 序列同源性比對表

一般認為，16S rDNA序列同源性＞99%，可以認為屬于同一個種；16S rDNA序列同源性＜97%，可以認為屬于不同的種；16S rDNA序列同源性小于93%，可以認為屬于不同的屬。

3 結論

由以上結果可以看出：生乳中存在可以將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽的微生物，BA-1、BA-3、BA-4為蠟樣芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌；BA-2為波茨坦短芽孢桿菌；BA-5為芽孢菌屬細菌。

從健康的奶牛乳房中剛擠下的牛乳中微生物數(shù)量極少，但由于擠乳的操作過程、器具、空間環(huán)境、貯存條件等因素都能增加生乳中的微生物種類和數(shù)量，且生乳中含有豐富的營養(yǎng)，在適宜的溫度條件下，微生物可快速繁殖。生乳中微生物的種類和數(shù)量可以通過加強乳牛場和乳品加工廠的日常衛(wèi)生管理，實行有效的冷卻處理和預殺菌工藝等措施加以控制和降低。降低生乳中的微生物數(shù)量，對生乳品質(zhì)的提升至關重要。此外，鑒于微生物的分離、篩選具有隨機性，生乳中可能還存在其他具備硝酸鹽還原能力的微生物，對此還有待研究。