馬琴 楊磊 劉喜婷

(甘肅省腫瘤醫(yī)院呼吸科，甘肅 蘭州 730050)

肺癌具有高轉(zhuǎn)移及侵襲能力，近些年其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)〔1〕。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟、多環(huán)節(jié)、多基因的復(fù)雜過(guò)程，涉及抑癌基因失活、癌基因激活等，因此，使失活的抑癌基因重新獲得活性，對(duì)于腫瘤治療具有重要意義。SRC激酶信號(hào)抑制劑(SRCIN)1又稱(chēng)為p140CAP，定位于17q21.1染色體，以往研究表明，SRCIN1在內(nèi)瘤基因(Src)失活中起重要作用，在腫瘤中起著抑癌基因的作用〔2，3〕。多種腫瘤中SRCIN1呈現(xiàn)低表達(dá)，如胃癌、肺癌等〔4，5〕，其表達(dá)可促進(jìn)腫瘤發(fā)展。過(guò)表達(dá)SRCIN1對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有抑制作用，如可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力〔6〕。肺癌中SRCIN1表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖，而上調(diào)SRCIN1表達(dá)可抑制肺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力〔7〕，但SRCIN1對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲和凋亡的影響及機(jī)制研究尚未明確。替莫唑胺是新一代口服烷化劑，可廣泛應(yīng)用于肺癌的治療。研究發(fā)現(xiàn)，替莫唑胺單獨(dú)使用可明顯延長(zhǎng)肺癌患者生存期，化療敏感性增加〔8〕；替莫唑胺可抑制肺癌細(xì)胞活力，阻滯細(xì)胞周期〔9〕。本研究旨在探討SRCIN1基因表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)及替莫唑胺化療敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及主要試劑和儀器 肺癌A549細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC。替莫唑胺購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究所(批號(hào)：100639-201302，純度為99.6%)；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)均購(gòu)自美國(guó)Gibco；噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Costar；Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基；增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl-2)相關(guān)X蛋白(Bax)和β-catenin抗體均購(gòu)自美國(guó)CST；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio Tek公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 A549細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、飽和濕度條件下37℃常規(guī)傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)為生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前24 h，以2×105個(gè)/ml細(xì)胞接種 A549細(xì)胞于6孔板，每孔2 ml，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞達(dá)80%～90%生長(zhǎng)匯合度時(shí)，將空質(zhì)粒(pcDNA3.1)和重組質(zhì)粒(pcDNA3.1-SRCIN1)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染參照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000說(shuō)明。轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染效果檢測(cè)。

1.3MTT實(shí)驗(yàn) A549細(xì)胞分成空白對(duì)照組、pcDNA3.1-SRCIN1組、替莫唑胺(200 μmol/L替莫唑胺處理細(xì)胞)組和pcDNA3.1-SRCIN1+替莫唑胺組。以5×103個(gè)/孔接種 A549細(xì)胞于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁，按照上述分組處理細(xì)胞，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，48 h后收集細(xì)胞，每孔中加入20 μl的MTT液，培養(yǎng)4 h后加150 μl的二甲基亞砜(DMSO)溶液，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm(吸光度值A(chǔ)值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4Transwell實(shí)驗(yàn) 將按照1.3分組處理后的4組A549細(xì)胞重懸于無(wú)血清培養(yǎng)液中，并將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105個(gè)/ml，加入已涂有Matrigel膠的 Transwell小室的上層，小室的下層加入DMEM培養(yǎng)液500 μl，每組3個(gè)復(fù)孔，12 h后終止實(shí)驗(yàn)，將小室取出，4%的多聚甲醛固定20 min，0.1%的結(jié)晶紫染色20 min，棉簽輕拭掉上膜面未穿過(guò)膜的細(xì)胞，400倍光學(xué)顯微鏡下，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)算在每個(gè)視野下穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)量，取均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 胰酶消化按照上述方法處理48 h的細(xì)胞，預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞，1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個(gè)/ml，取500 μl的單細(xì)胞懸液，加Annexin V-FITC 5 μl和PI 10 μl，冰塊上避光孵育15～20 min，上機(jī)前加1×結(jié)合緩沖液400 μl，1 h內(nèi)通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6Western印跡法 PBS洗滌按照上述方法處理48 h的細(xì)胞，適量放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解液提取細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法定量蛋白，每孔道上樣40 μg裂解蛋白，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，分離后的蛋白經(jīng)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜，5%脫脂奶粉封閉膜1 h，加一抗，即皆按照1∶1 000稀釋的PCNA、MMP-2、Bax和β-catenin抗體，以GAPDH作為內(nèi)參，4℃孵育過(guò)夜，次日，洗膜，加辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h，洗膜，加電化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光液，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果觀察。以目的蛋白和GAPDH蛋白灰度值比值作為各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SRCIN1的A549細(xì)胞SRCIN1的蛋白表達(dá) pcDNA3.1-SRCIN1組細(xì)胞SRCIN1的蛋白相對(duì)表達(dá)量(0.611±0.058)顯著高于空白對(duì)照組(0.072±0.009,P<0.05)，pcDNA3.1組SRCIN1的蛋白相對(duì)表達(dá)量(0.086±0.010)與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組差異顯著(F=239.637，P=0.000)。見(jiàn)圖1。

圖1 3組A549細(xì)胞SRCIN1的蛋白表達(dá)

2.2各組A549細(xì)胞活力檢測(cè) pcDNA3.1-SRCIN1組細(xì)胞活力(0.546±0.047)和替莫唑胺組細(xì)胞活力(0.502±0.042)均顯著低于空白對(duì)照組(0.872±0.069，P<0.05)，而pcDNA3.1-SRCIN1+替莫唑胺組細(xì)胞活力(0.329±0.034)明顯低于pcDNA3.1-SRCIN1組和替莫唑胺組(P<0.05)。4組差異顯著(F=62.384，P=0.000)。

2.3各組A549細(xì)胞侵襲能力 pcDNA3.1-SRCIN1組〔(145.3±5.1)個(gè)〕和替莫唑胺組穿膜細(xì)胞數(shù)〔(130.1±4.5)個(gè)〕均顯著低于空白對(duì)照組〔(172.6±7.4)個(gè)〕，高于pcDNA3.1-SRCIN1+替莫唑胺組〔(92.2±3.7)個(gè)，P<0.05〕。

2.4各組A549細(xì)胞凋亡 pcDNA3.1-SRCIN1組細(xì)胞凋亡率〔(20.85±1.63)%〕和替莫唑胺組細(xì)胞凋亡率〔(27.31±2.04)%〕均顯著高于空白對(duì)照組〔(4.56±0.32)%〕，而pcDNA3.1-SRCIN1+替莫唑胺組細(xì)胞凋亡率〔(38.82±4.53)%〕顯著高于pcDNA3.1-SRCIN1組和替莫唑胺組(P<0.05)。4組差異顯著(F=89.419，P=0.000)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組A549細(xì)胞凋亡

2.5各組A549細(xì)胞Wnt信號(hào)通路下游增殖、侵襲、凋亡相關(guān)的PCNA、MMP-2、Bax及β-catenin的蛋白表達(dá) pcDNA3.1-SRCIN1組和替莫唑胺組PCNA、MMP-2和β-catenin的蛋白表達(dá)均顯著低于空白對(duì)照組，Bax蛋白表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組(均P<0.05)；pcDNA3.1-SRCIN1+替莫唑胺組PCNA、MMP-2和β-catenin的蛋白表達(dá)均顯著低于pcDNA3.1-SRCIN1組和替莫唑胺組，Bax蛋白表達(dá)顯著高于pcDNA3.1-SRCIN1組和替莫唑胺組(均P<0.05)。見(jiàn)圖3和表1。

A：空白對(duì)照組；B：pcDNA3.1-SRCIN1組；C：替莫唑胺組；D：pcDNA3.1-SRCIN1+替莫唑胺組圖3 各組A549細(xì)胞Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

組別β-cateninPCNAMMP-2Bax空白對(duì)照組0.768±0.0650.524±0.0460.222±0.0210.067±0.008pcDNA3.1-SRCIN1組0.358±0.0381)2)0.238±0.0251)2)0.118±0.0141)2)0.152±0.0161)2)替莫唑胺組0.211±0.0221)2)0.203±0.0181)2)0.106±0.0121)2)0.183±0.0201)2)pcDNA3.1-SRCIN1+替莫唑胺組0.106±0.0100.057±0.0080.041±0.0070.355±0.036F/P值161.959/0.000146.446/0.00081.122/0.00086.994/0.000

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05；與pcDNA3.1-SRCIN1+替莫唑胺組：2)P<0.05

3 討 論

肺癌的發(fā)生發(fā)展與癌基因表達(dá)升高、抑癌基因表達(dá)缺失或降低等變化密切相關(guān)，且一些基因會(huì)隨著肺癌惡性程度變化而變化〔10〕，提示分子靶向治療是肺癌治療的一個(gè)有效途徑。SRCIN1基因與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如乳腺癌中SRCIN1表達(dá)與預(yù)后不良呈正相關(guān)〔3〕；SRCIN1過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)由miR-20a引起的多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖〔11〕。肺癌細(xì)胞SRCIN1表達(dá)下調(diào)，沉默SRCIN1表達(dá)均可促進(jìn)細(xì)胞增殖〔5〕。研究指出，上調(diào)SRCIN1表達(dá)可抑制肺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力〔7〕。本研究提示SRCIN1過(guò)表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用。替莫唑胺為常見(jiàn)的化療藥物，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如肝癌、膠質(zhì)瘤等〔12，13〕，且有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)一些基因表達(dá)可增加化療藥物的化療敏感性，如靶向沉默Wip1基因可以顯著增加替莫唑胺對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用〔14〕。miR-346可靶向SRCIN1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、克隆形成、侵襲和遷移能力，降低細(xì)胞凋亡及多西紫杉醇敏感性〔15〕。SRCIN1過(guò)表達(dá)是否可增加替莫唑胺化療敏感性還未明確。本文結(jié)果提示SRCIN1過(guò)表達(dá)可增加替莫唑胺化療敏感性。

Wnt信號(hào)是一種細(xì)胞間的分泌蛋白，在進(jìn)化上極為保守，參與細(xì)胞的增殖、凋亡、發(fā)育等過(guò)程，其異常激活可引起細(xì)胞增殖和分化異常，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生〔16〕。β-catenin為Wnt信號(hào)的關(guān)鍵分子，通過(guò)與細(xì)胞膜上的鈣黏蛋白和細(xì)胞骨架結(jié)合發(fā)揮細(xì)胞結(jié)構(gòu)維持及黏附作用，β-catenin異常堆積與肺癌的多種臨床病理特征密切相關(guān)〔17〕。PCNA是一種細(xì)胞核蛋白，與DNA的復(fù)制密切相關(guān)，可調(diào)節(jié)細(xì)胞由G1期向S期過(guò)程，其表達(dá)高低可衡量腫瘤惡性程度及預(yù)后，因此目前已作為腫瘤細(xì)胞增殖活性檢測(cè)的指標(biāo)〔18〕。腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的基本步驟是降解和破壞血管基膜及細(xì)胞外基質(zhì)，MMPs是一組重要的蛋白酶，可降低細(xì)胞外基質(zhì)核基底膜，腫瘤細(xì)胞分泌MMPs的能力與細(xì)胞的侵襲能力呈正相關(guān)。MMP-2高表達(dá)可促進(jìn)包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤侵襲和遷移能力〔19，20〕。Bax為促凋亡蛋白，屬于Bcl-2家族成員，上調(diào)表達(dá)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡〔21〕。本研究提示SRCIN1過(guò)表達(dá)和替莫唑胺可通過(guò)下調(diào)Wnt信號(hào)抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。