劉文玲，冮潔*，解彬，劉煜珺，蘭曉勇，韓琳，陳濤濤，龐士磊，鄧海平

1(大連民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連，116600)2(銅仁科學(xué)院，梵凈山生物資源研究所，貴州 銅仁，554300)

香菇(Lentinusedodes)屬于多孔菌目(Polyporales)、香菇科(Lentinaceae)[1]，是世界第二大食用菌，我國特產(chǎn)之一，民間素有“山珍”之稱。香菇具有抗病毒、抗腫瘤等多種藥理活性，也具有提高免疫力等功能[2-3]。硒(Selenium，Se) 是一種保障機體持久健康的必不可少的微量元素，人體無法合成，須從外界攝取。硒能有效緩解人體內(nèi)汞、鎘、鉈、砷等元素的毒性作用，對鉬、鉻、銅、硫等元素有拮抗作用，還有預(yù)防心血管疾病、抗衰老、抗病毒、抗氧化、防癌等作用，與人體健康密切相關(guān)[4-7]。實踐證明，適當(dāng)補硒對因缺硒引起的地方病可取得良好的改善效果[8-10]。我國國土面積的72%屬于低硒或缺硒土壤，這些地區(qū)的居民硒攝入量普遍偏低，制約著中國食物硒營養(yǎng)狀況[11]。香菇可以將無機硒轉(zhuǎn)化為人體所需的有機硒，而促進(jìn)人體的吸收和利用[12]。因此，通過施用外源硒把非生物活性和毒性較高的無機硒轉(zhuǎn)化為毒性低、安全性高且具有活性的有機硒，是改善和滿足食物鏈中硒水平不足的廉價且可行的方法。由此，用生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)富硒香菇成為國內(nèi)外研究的熱點[13]。目前對富硒香菇多糖[14-17]研究的較多，而對其蛋白質(zhì)研究較少，特別是對其富硒香菇子實體蛋白質(zhì)進(jìn)行營養(yǎng)價值評價未見報道。本文以富硒香菇為材料，考察硒在香菇子實體中的分布規(guī)律，并根據(jù)氨基酸平衡理論對富硒香菇蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值進(jìn)行評價，為富硒香菇開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗供試材料為香菇808，配方為：水分含量65%左右；干物質(zhì)中木屑78%、麩皮20%、石膏2%；硒濃度分別為20、40、60、80、100 mg/kg，并以未加硒做空白對照，在遼寧省大連寶野農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司香菇栽培基地以香菇代料栽培方式進(jìn)行栽培。

1.2 試劑

亞硒酸鈉：湖南奧馳生物科技有限公司；HNO3、H2O2、濃HNO3、濃H2SO4、(NH4)2SO4、濃HCl、95%乙醇、無水乙醇、NaOH、正丁醇、氯仿：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司

1.3 儀器與設(shè)備

GSB-090微波消解儀，美國培安有限公司；GSB-076電感耦合等離子質(zhì)譜儀，Agilent；LC-E109S電磁爐，廣州順德忠臣有限公司；A11BS25粉碎機，IKA公司；T18 digital勻漿機，IKA公司；FW100高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司;SCIENTZ-12N真空冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；DH-9053A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；HH-ZK4數(shù)顯恒溫水二列四孔智能水浴鍋，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；AL204電子精密天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；H-2050R臺式高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 香菇子實體硒含量測定

按照GB 5009.268—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中多無素的測定》電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定硒含量

1.4.2 香菇子實體蛋白質(zhì)硒含量測定

取1g樣品加100 mL的NaOH溶液(pH為10)，50 ℃水浴提取4 h，加(NH4)2SO4至95%飽和度，冰箱中靜置過夜，離心后得蛋白質(zhì)沉淀，沉淀加一定量的水溶解，倒入透析袋中，將其封口，再放在水中進(jìn)行持續(xù)透析，48 h后取出透析袋，將透析袋中的樣品進(jìn)行離心，離心后取沉淀，進(jìn)行冷凍干燥，干燥后為粗蛋白質(zhì)，并稱量質(zhì)量。將干燥后的蛋白質(zhì)加入到消解罐中，再加入1 mLH2O2溶液，3 mL濃HNO3溶液，微波消化后加水定容至25 mL，放置后用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定其硒含量。

1.4.3 香菇子實體多糖硒含量測定

取2 g樣品加60 mL水，放入超聲波發(fā)生器中(超聲25 min，超聲溫度為80 ℃)，拿出放入90 ℃水浴鍋1 h，過濾、濃縮、加入3倍體積95%乙醇，靜置后離心，取出沉淀物加8 mL水，4 mL Sevage試劑(V(氯仿)∶V(正丁醇)=5∶1)，Sevage法去除蛋白，萃取30 min后分層，上層液體加3倍體積95%乙醇后離心，沉淀真空冷凍干燥，得粗多糖，稱量質(zhì)量，將干燥后的樣品按1.4.2方法繼續(xù)測定。

1.4.4 香菇子實體核酸硒含量測定

取2 g樣品加30 mL 12% NaCl溶液，90 ℃水浴提取2 h，抽濾，濾渣重復(fù)提取1次，合并上清液，Sevage試劑(V(氯仿)∶V(正丁醇)=5∶1)去除蛋白后，用6mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至2.5，4 ℃靜置12 h，10 000轉(zhuǎn)離心8 min，沉淀真空冷凍干燥后，取干燥后的樣品按1.4.2方法繼續(xù)測定。

1.4.5 香菇子實體有機硒含量測定

取0.5 g左右菌粉記錄質(zhì)量，加一定量的水溶解，倒入透析袋中，將其封口，再放在水中進(jìn)行持續(xù)透析，48 h后取出透析袋，將透析袋中的樣品進(jìn)行離心，離心后取沉淀，進(jìn)行冷凍干燥，取干燥后的樣品按1.4.2方法繼續(xù)測定。

1.4.6 香菇子實體氨基酸種類及含量測定

待測樣品置于6 mol/L HCl于110 ℃水解24 h，用全自動氨基酸分析儀S-433D檢測，由賽卡姆(北京)科學(xué)儀器有限公司完成。

氨基酸含量分析采用氨基酸比值系數(shù)(ratio coefficient of amino acid， RCAA)，氨基酸比值系數(shù)分(score of amino of amino acid， SRCAA)，化學(xué)評分(chemical score，CS)按FAO的方法[18-19]計算，氨基酸評分(amino acid score，AAS)、必需氨基酸指數(shù)(essential amino acid index，EAAI)、生物價(biological value，BV)和營養(yǎng)指數(shù)(nutrient index，NI)按BANO等的方法[20]進(jìn)行計算。

1.4.7 數(shù)據(jù)分析處理

采用Excel 2010和SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理及統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同添加外源硒濃度對香菇子實體硒含量的影響

由圖1可以看出，隨著添加外源硒濃度的增加，香菇的硒濃度有顯著的提高，當(dāng)添加亞硒酸鈉濃度為100 mg/kg時，栽培出的香菇硒濃度可以達(dá)到225.13 mg/kg，與未富硒栽培的香菇相比含量顯著增加，提高了81.16倍(P<0.05)，高于其他一些富硒食用菌，如俞濤等[21]對秀珍菇進(jìn)行富硒培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)隨著栽培料中硒處理濃度的增大，其子實體中硒含量呈線性增長，在硒濃度為100 mg/kg時子實體硒含量可達(dá)114.56 μg/g。牛林茹[22]對黃白側(cè)耳進(jìn)行富硒培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在處理硒濃度為0.8 g/kg時栽培出的黃白側(cè)耳子實體硒含量最高，達(dá)到11.43 μg/g。茆廣華[23]發(fā)現(xiàn)當(dāng)富硒濃度達(dá)到57.134 mg/kg時，灰樹花子實體總硒含量最大為33.10 μg/g。李玲飛[24]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中硒濃度為2.85 μg/g和5.71 μg/g時，花菇子實體硒含量可達(dá)54.5 μg/g和48.6 μg/g。

圖1 香菇子實體中硒含量Fig.1 The content of selencum in Lentinus edodes

2.2 硒在香菇中的分布規(guī)律

硒的化學(xué)形態(tài)主要分為無機態(tài)和有機態(tài)。硒在生態(tài)鏈中可以更有效地將無機硒轉(zhuǎn)化為有機硒，有機態(tài)硒主要是硒代謝過程中產(chǎn)生的一些有機小分子如R-Se-R形式的氨基酸及大分子產(chǎn)物如含硒多肽、含硒多糖和含硒RNA等[25]。如表1所示。

表1 硒在香菇中的分布情況Table 1 The distribution of selenium in Lentinus edodes

注：富硒香菇是在添加亞硒酸鈉濃度為60 mg/kg時栽培的香菇

富硒香菇與未富硒香菇相比，總硒含量提高了111.97 mg/kg，有機硒含量提高了64.97 mg/kg，富硒栽培可極大提高香菇中總硒與有機硒含量。富硒香菇中蛋白質(zhì)硒含量分別為多糖硒與核酸硒含量的19倍和20倍，蛋白硒占有機硒比率為89.95%，遠(yuǎn)高于多糖硒與核酸硒所占有機硒比率，由此可見，蛋白硒是有機硒中最主要的組成成分。因此，可以說明蛋白質(zhì)是硒在香菇中最主要的有機載體。硒的功能不僅取決于硒的含量，也取決于硒的形態(tài)，固體栽培時子實體中的硒是經(jīng)生物轉(zhuǎn)化的有機硒化合物。

2.3 富硒栽培對香菇子實體氨基酸組成的影響

由表2可以看出，在20 mg/kg到60 mg/kg硒濃度下栽培，可以提高香菇蛋白質(zhì)的含量，在硒濃度為20 mg/kg時，使富硒香菇蛋白質(zhì)含量增加5.13%，在硒濃度為60 mg/kg時，富硒香菇蛋白質(zhì)含量增加1.94%。當(dāng)硒濃度增大到80 mg/kg和100 mg/kg時，不利于香菇蛋白質(zhì)的合成，蛋白質(zhì)含量下降。

本實驗對不同富硒濃度的香菇氨基酸進(jìn)行了測定。如表3所示，香菇中被檢測出含有16 種氨基酸，其中包括除色氨酸以外的7種必需氨基酸。

表2 不同富硒濃度香菇子實體蛋白質(zhì)含量比較Table 2 Protein contents in different concentrations of selenium-enriched Lentinus edodes

注：Se20、Se40、Se60、Se80、Se100，添加亞硒酸鈉濃度分別為20、40、60、80、100mg/kg；表中數(shù)據(jù)后相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，下表同。

表3 不同富硒濃度香菇子實體氨基酸含量比較Table 3 Amino acid contents in different concentrations of selenium-enriched Lentinus edodes

注：EAA必需氨基酸(essential amino acids)；TAA氨基酸總量(amount of total amino acid)；NEAA非必需氨基酸(non-essential amino acids)。

香菇中氨基酸總含量為39.13%，其中必需氨基酸含量占總氨基酸含量的25.8%，EAA/NEAA(E/N)為0.531，低于FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的必需氨基酸含量40%和E/N值0.6[19]。添加濃度分別為20、40、80 mg/kg的亞硒酸鈉時，香菇氨基酸總量分別降低4.93%、6.01%、19.01%，當(dāng)添加亞硒酸鈉濃度為60、100 mg/kg時，香菇子實體內(nèi)必需氨基酸含量比空白組分別升高了5.49%、3.02%。香菇中含量最高的氨基酸為谷氨酸，它能與氯化鈉發(fā)生反應(yīng)，生成食物鮮味物質(zhì)，呈味性強，廣泛用于烹飪和食品加工。除此之外，在醫(yī)藥、化工、農(nóng)業(yè)等方面也都有著廣泛的用途。

2.4 富硒香菇蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值的評價

2.4.1 香菇子實體蛋白質(zhì)的化學(xué)評分結(jié)果

表4為香菇子實體蛋白質(zhì)的化學(xué)評分計算結(jié)果。

表4 富硒栽培對香菇子實體中蛋白質(zhì)化學(xué)評分的影響Table 4 Effects of different concentrations of selenium treatment on the chemical score(CS)of protein in Lentinus edodes

香菇未富硒空白組苯丙氨酸的化學(xué)評分為53.37，添加亞硒酸鈉濃度為20、40、60、100 mg/kg時香菇化學(xué)評分均升高，分別比未富硒組提高了 6.22%、0.41%、1.78%、7.74%。當(dāng)添加亞硒酸鈉濃度為80 mg/kg時化學(xué)評分比未富硒組降低了6.76%。

2.4.2 香菇子實體必需氨基酸指數(shù)、生物價及營養(yǎng)指數(shù)結(jié)果

由表5可知，添加亞硒酸鈉濃度為60、100 mg/kg時必需氨基酸指數(shù)、生物價、營養(yǎng)指數(shù)均升高，必需氨基酸指數(shù)比未富硒組分別提高了4.59%、6.10%；生物價分別提高了5.41%、8.42%；營養(yǎng)指數(shù)分別提高了6.51%、5.14%。當(dāng)添加亞硒酸鈉濃度為20、40、80 mg/kg時，必需氨基酸指數(shù)、生物價、營養(yǎng)指數(shù)均降低，必需氨基酸指數(shù)比未富硒組分別降低了6.74%、8.38%、5.28%；生物價分別降低7.85%、10.65%、5.14%，營養(yǎng)指數(shù)分別降低了1.71%、5.93%、21.50%。

表5 富硒栽培對香菇子實體中必需氨基酸指數(shù)、生物價及營養(yǎng)指數(shù)的影響Table 5 Effects of different concentrations of selenium treatment on the essential amino acid index(EAAI)、biological valence(BV)、nutritional index(NI)of protein in Lentinus edodes

2.4.3 香菇子實體氨基酸比值系數(shù)評分結(jié)果

若某種蛋白質(zhì)氨基酸種類齊全，比例合理，越接近FAO/WHO氨基酸模式要求，則說明該蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值越高，能滿足人體營養(yǎng)需求。按照公式分別計算不同硒富集濃度香菇的RAA、RCAA、SRCAA。根據(jù)氨基酸比值系數(shù)法計算出的RCAA值越接近1，說明該食品蛋白質(zhì)氨基酸組成比例越接近FAO/WHO模式蛋白氨基酸。當(dāng)RCAA>1表示該必需氨基酸相對過剩，RCAA<1則相反，說明該必需氨基酸相對不足，RCAA值最小者為該蛋白第一限制氨基酸。由表6可知，香菇的第一限制氨基酸是苯丙氨酸?，F(xiàn)代研究認(rèn)為不僅氨基酸不足影響蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值，氨基酸過剩同樣也限制蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值[26]。香菇蛋白的氨基酸組成中，蘇氨酸含量較高。因此，可根據(jù)蛋白質(zhì)互補理論[27]將香菇蛋白作為食品強化劑，與其他蛋白互補，提高各種食品的營養(yǎng)價值。

如果食物蛋白質(zhì)的氨基酸組成與氨基酸模式一致，則SRC為100；若SRC越大，食物蛋白質(zhì)的RC越分散，表示這些氨基酸在氮基酸平衡上做的負(fù)貢獻(xiàn)越大；若SRC越小，表示蛋自質(zhì)的營養(yǎng)價值越差。由表6還可以看出添加亞硒酸鈉濃度為20 mg/kg和100 mg/kg時，氨基酸比值系數(shù)評分有所升高，分別高于未富硒組3.3%和2.64%，與未富硒組差異均不顯著(P>0.05)這說明此濃度下香菇蛋白質(zhì)的氨基酸組成與模式氨基酸更接近，對氨基酸平衡所做的貢獻(xiàn)也較大，且香菇與豬肉、牛肉[28]營養(yǎng)價值接近，具有較高的利用價值。

表6 富硒香菇氨基酸比值系數(shù)分比較 單位：mg/100 gTable 6 Effects of different concentrations of Se treatment on the amino acid ratio in Lentinus edodes

3 結(jié)論

食用菌主要通過菌絲體對微量元素進(jìn)行吸收[29]，與綠色植物相比，食用菌更能積累高濃度的微量元素[30]。實驗表明結(jié)果，蛋白質(zhì)是硒在香菇子實體中最主要的有機載體。隨著添加外源硒濃度的增加，香菇的硒濃度有顯著的提高(P<0.05)。香菇子實體內(nèi)含有16種氨基酸，其中包括除色氨酸以外的7種必需氨基酸，香菇子實體中含量最高的為谷氨酸。添加亞硒酸鈉的適宜濃度為60mg/kg，富硒栽培香菇中必需氨基酸含量、化學(xué)評分、必需氨基酸指數(shù)、生物價、營養(yǎng)指數(shù)分別比未富硒組提高了5.49%、1.78%、4.59%、5.41%和6.51%，說明富硒栽培可提高香菇子實體的蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值，并可作為富硒食品營養(yǎng)強化劑。