郭鳳柱，譚之磊，時藝翡，宋富，鐘其頂，賈士儒*

1(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457)2(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津，300457)3(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015)

ε-聚-L-賴氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)是目前從自然界中已發(fā)現(xiàn)的兩種氨基酸同聚物之一，它是由微生物代謝合成的(主要為放線菌[1]，另外個別細菌也可以合成[2])含有25～35個L-氨基酸殘基的同聚氨基酸，這些L-賴氨酸(L-Lys)殘基通過α-羧基和ε-氨基連接[3-4]。因其具有安全性高[5]、抑菌譜廣[6-8]、水溶性好和熱穩(wěn)定性強[9-10]等特性，ε-PL已廣泛應用于食品、醫(yī)學和生物材料等領(lǐng)域[11-17]。我國于2014年4月批準了ε-聚賴氨酸及其鹽酸鹽作為食品添加劑新品種[18]。為了適應ε-PL在食品應用方面需求量的增大，許多研究者已投入到旨在提高ε-PL產(chǎn)量的研究中。但由于ε-PL的生物合成及整體調(diào)控機制尚不十分明確[19]，因此，對其生物合成過程中的代謝網(wǎng)絡(luò)進行定量分析是十分必要的。

13C同位素示蹤技術(shù)作為代謝流分析的方法之一，因其可以準確、快速、直觀的反應代謝流向和流量，受到越來越多科研人員的青睞。13C同位素示蹤研究中，由于中間代謝物反應速度快、濃度低、難以及時定量分析，而菌體蛋白氨基酸作為菌體的重要組成成分，并與產(chǎn)物前體之間有著很好的對應關(guān)系。因此，可以根據(jù)菌體蛋白水解氨基酸的標記信息來推測胞內(nèi)代謝物的標記信息，進而根據(jù)胞內(nèi)標記代謝物的平衡和代謝網(wǎng)絡(luò)的化學計量關(guān)系進行代謝通量分析[20]。所以，菌體蛋白水解氨基酸的分離提取是開展13C穩(wěn)定同位素示蹤研究的關(guān)鍵技術(shù)問題。鐘其頂?shù)炔捎玫捣ǔ晒χ苽淞酸劸平湍妇w蛋白氨基酸[21]；申鐵[22]、ZAMBONI等[23]采用高溫(100 ℃)干燥法對大腸桿菌菌體蛋白氨基酸進行了分離；但是關(guān)于鏈霉菌菌體蛋白氨基酸的分離制備目前鮮有報道。因此，通過采用不同預處理手段，對酸水解后的菌體氨基酸進行干燥，以探索不同干燥方法對淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌菌體蛋白氨基酸分離鑒定的影響，并建立高效的菌體蛋白氨基酸制備方法，為今后實施13C穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)在鏈霉菌中的應用，揭示ε-PL發(fā)酵過程的代謝機理提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種和培養(yǎng)基

淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(StreptomycesdiastatochromogenesCGMCC3145)，由天津科技大學從海南島土壤樣品中分離篩選獲得，現(xiàn)保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)。

斜面固體培養(yǎng)基(Bennett’s，g/L)：葡萄糖 10，牛肉膏 1，蛋白胨 2，酵母浸粉 1，瓊脂 15～20，2 mol/L NaOH調(diào)pH 7.7，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

種子/發(fā)酵培養(yǎng)基(M3G，g/L)：葡萄糖 50，酵母浸粉 5，(NH4)2SO410，MgSO4·7H2O 0.5，K2HPO4·3H2O 0.8，KH2PO41.36，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03，ZnSO4·7H2O 0.04，氨水調(diào)pH 7.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.2 試劑

氨基酸標準品(Sigma-Aldrich公司，美國)；無水葡萄糖(Solarbio公司，中國)；N-(特丁基二甲基硅烷)-N-甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA≥95%，Sigma-Aldrich公司，瑞士)；N，N-二甲基甲酰胺(DMF，色譜純，Adamas公司，中國)；HCl(優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司)等。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5795C氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)，美國Agilent Technologies；HYG-Ⅱ迴轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖床，上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司；LRH-100-S恒溫恒濕培養(yǎng)箱，韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；5804R冷凍離心機，德國Eppendorf公司；FD-1真空冷凍干燥機，上海田楓實業(yè)有限公司；HN 200多功能氮吹儀，山東海能科學儀器有限公司；GZX-9070 MBE電熱鼓風干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠等。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

將保藏菌種接至Bennett’s固體斜面，30 ℃，濕度50%的條件下恒溫恒濕培養(yǎng)5～7 d，直至長滿孢子，置于4 ℃冰箱中保存待用。

從孢子斜面挑一環(huán)孢子接于含有100 mL M3G液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，30 ℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)30 h。

將種子液以6%接種量接于含有100 mL M3G液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，30 ℃、180 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)。隔一定時間取樣，確定發(fā)酵液中的菌體生長。

1.3.2 樣品處理方法

取對數(shù)中后期發(fā)酵液，4 ℃ 1 2000×g離心5 min，收集菌體；將菌體用無菌水洗2次，取約100 mg濕菌體于15 mL離心管中，加入4 mL的6 mol/L鹽酸后在85 ℃下水解24 h[24]，水解液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后獲得淡黃色氨基酸液體，分別取50 μL氨基酸標準液、菌體水解液于1.5 mL新的EP管中，樣品分別進行真空冷凍干燥、氮吹儀40 ℃吹干、烘箱95 ℃烘干。最終得到黃色氨基酸晶體。

1.3.3 氨基酸的衍生

加入100 μL DMF輔助衍生試劑，振蕩混勻，然后加100 μL MTBSTFA衍生試劑，再次震蕩混勻，80 ℃衍生反應60 min，反應完成后冷卻至室溫，離心取上清，待進入GC-MS檢測[21,23]。

1.3.4 氨基酸的測定

色譜條件：HP-5色譜柱，載氣為氦氣，柱流速1.0 mL/min，進樣口溫度250 ℃，升溫程序為：起始溫度120 ℃，保持2 min，以3.0 ℃/min升溫至250 ℃，再以10 ℃/min升溫至270 ℃保留10 min；進樣體積1 μL，分流比10∶1[21,23]。

1.3.5 生物量的測定

將化學分析濾紙編號，95 ℃烘干至恒重，稱量，備用。吸取4 mL發(fā)酵液，6 000×g離心10 min，棄掉上清液。將菌體沖洗至濾紙上，并用適量去離子水洗滌2～3次，95 ℃烘干至恒重，稱量，計算生物量(biomass, g/L)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體蛋白氨基酸制備取樣點的確定

根據(jù)方法1.2.1，菌株S.diastatochromogenesCGMCC3145種子培養(yǎng)30 h后，以6%接種量轉(zhuǎn)接至M3G發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每隔4 h取樣分析其生物量的變化，菌株CGMCC3145的生長曲線如圖1所示。在菌體生長的指數(shù)中后期，其細胞內(nèi)代謝系統(tǒng)達到穩(wěn)定狀態(tài)[11]，所以選取24 h作為菌體氨基酸制備的取樣點。

圖1 發(fā)酵培養(yǎng)基中菌株CGMCC3145的生長曲線Fig.1 Growth curve of strain S. diastatochromogenes CGMCC3145 cultivated in fermentation medium

2.2 氨基酸標品的測定

對氨基酸標準品采用不同干燥方法處理后，經(jīng)衍生化，進行GC-MS分析，由圖2總離子流圖中峰的定性分析可知：(1)標準品中16種氨基酸均能被檢測(僅烘干法中鳥氨酸未檢出)；(2)出峰順序依次為：丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、鳥氨酸(精氨酸)、賴氨酸、組氨酸、酪氨酸；(3)各氨基酸的分離效果較好。

A-真空冷凍干燥法；B-氮吹法；C-烘干法圖2 不同干燥處理方法下氨基酸標品的氣相色譜圖Fig.2 The GC chromatogram of amino acid standards with different drying treatment

2.3 菌體蛋白氨基酸的測定

同樣，菌株S.diastatochromogenesCGMCC3145菌體蛋白氨基酸采用不同干燥方法處理后，再經(jīng)衍生化，進行GC-MS分析，總離子流圖結(jié)果如圖3所示(各個菌體蛋白氨基酸保留時間與氨基酸標準品保留時間基本一致)。由于菌體蛋白鹽酸水解過程中，天冬酰胺轉(zhuǎn)化為天冬氨酸，谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸，色氨酸、半胱氨酸被破壞。因此，最多可檢測出16種氨基酸。通過對總離子流圖中峰的定性分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)真空冷凍干燥處理后(圖3-A)，檢測到16種氨基酸；采用氮吹法處理后(圖3-B)，檢測到14種氨基酸，相較于真空冷凍干燥法，并未有鳥氨酸、組氨酸檢出；采用烘干法處理后(圖3-C)，共有15種氨基酸檢出，相較于真空冷凍干燥法，鳥氨酸未檢出。這可能是由于鳥氨酸在樣品中本身含量極低(由表1可知)，且經(jīng)氮吹法或烘干法處理后，受氨基酸熱降解影響進而無法被檢出。

A-真空冷凍干燥法；B-氮吹法；C-烘干法圖3 不同干燥處理方法下菌體蛋白氨基酸的氣相色譜圖Fig.3 The GC chromatogram of protein-bound amino acids with different drying treatment

表1 不同預處理方式對獲得菌體蛋白氨基酸種類及含量的影響Table 1 The effect of different pretreatment on protein-bound amino acids

注：“-”表示未檢出。

進一步對不同處理方式下菌體蛋白氨基酸的GC-MS譜圖進行分析，發(fā)現(xiàn)對于同一氨基酸而言，不同的預處理方法對其含量有顯著影響，以L-Alanine為例：使用真空冷凍干燥法檢測的L-Alanine含量分別是使用烘干法和氮吹法檢測含量的1.46倍和1.86倍；而對于相對含量較少且對溫度敏感的組氨酸[25]而言，使用真空冷凍干燥法檢測的含量是使用烘干法檢測含量的11.65倍，氮吹法處理組則未檢出組氨酸，這可能是由于氮吹法干燥過程較為迅速且通過氮氣對受熱樣品進行吹掃增大了樣品受熱面積從而加劇了組氨酸熱降解。而在代謝通量分析中，胞內(nèi)代謝物的標記信息是根據(jù)菌體蛋白氨基酸的標記信息推測的[20,23,26]，因此，選取真空冷凍干燥法作為淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌菌體蛋白氨基酸制備的方法。

3 結(jié)論

對菌體蛋白水解氨基酸分別用不同的處理方法進行干燥處理，無論從氨基酸檢出的種類還是從氨基酸檢出的峰面積(含量)角度考慮，真空冷凍干燥的方法均優(yōu)于其余2種方法。本文建立了淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌中菌體蛋白氨基酸的制備方法，為今后開展13C同位素代謝通量分析、深入了解淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌中心碳代謝途徑中的通量分布，對生產(chǎn)菌株合理的代謝改造提供了技術(shù)保障。