周大祥，熊 書，謝桂香

(1.重慶三峽學(xué)院 生命科學(xué)與工程學(xué)院，萬州 404120；2.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，萬州 404120)

建立一種快速檢測(cè)細(xì)菌活菌的方法具有一定的應(yīng)用價(jià)值。MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽]是一種最簡單的方法，MTT作為一種水溶性的黃色染料，被活菌的脫氫酶系還原生成不溶于水的藍(lán)紫色甲臜晶體，而死菌不能將MTT還原成甲臜[1]。當(dāng)有機(jī)溶劑溶解生成的甲臜晶體后，能夠被分光光度計(jì)定量測(cè)定，其濃度與活菌數(shù)量成正比[2-3]。MTT法最初用于培養(yǎng)貼壁動(dòng)物細(xì)胞的生物學(xué)及生物醫(yī)學(xué)研究[4-6]。相比傳統(tǒng)的方法，MTT法具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)槔?6孔板可以進(jìn)行大量測(cè)定，而不用花費(fèi)大量時(shí)間進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)或者同位素測(cè)定[7]。但是常規(guī)的MTT法使用96孔板時(shí)，吸光度讀數(shù)不穩(wěn)定。在測(cè)定大腸桿菌時(shí)，甲臜晶體聚集和沉淀在細(xì)胞底部，而且用DMSO溶解時(shí)，不能完全去除培養(yǎng)基，這樣會(huì)不斷地增加背景吸收(10～60 min內(nèi))，因而不能準(zhǔn)確地獲得吸光度值[8]。

青枯菌(Ralstoniasolanacearum)是全球范圍內(nèi)造成嚴(yán)重危害的重要植物病原細(xì)菌，可侵染50多個(gè)科的數(shù)百種植物，是世界上分布最廣、危害最重且最難防治的重大細(xì)菌性病害。本研究的目的是對(duì)MTT法檢測(cè)青枯菌活菌進(jìn)行優(yōu)化，建立一種有效快速檢測(cè)青枯菌活菌的方法。通過研究MTT用量、反應(yīng)時(shí)間、最佳檢測(cè)波長和甲臜晶體溶解等過程，得到更準(zhǔn)確、穩(wěn)定的吸光度值。本研究建立了一種快速檢測(cè)細(xì)菌活菌的方法，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：青枯菌從煙草植株上分離，由西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院饋贈(zèng)。NA培養(yǎng)基培養(yǎng)，菌株在常溫下保存于滅菌蒸餾水中。

試劑：MTT(四甲基偶氮唑鹽，Amresco公司)，臨用前用無菌蒸餾水溶解，濃度為5 mg/mL，60℃水助溶，4℃避光保存。三聯(lián)液(SDS 10 g，異丙醇5 mL，10 mol/L HCl 0.1 mL)，用蒸餾水溶解配成100 mL溶液，4℃保存。

儀器：島津紫外可見掃描分光光度儀、Bio-Rad680酶標(biāo)儀

1.2 方法

1.2.1 青枯菌死活菌懸液的制備

青枯菌接種于20 mL NA液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)(28℃，250 r/min)至A600約為3.0(以NA培養(yǎng)基為對(duì)照)，得到活菌懸液(細(xì)菌密度約為2.0×109CFU/mL)。

1.2.2 最大吸收波長的確定

取搖床培養(yǎng)的青枯菌懸液1 mL，10 000 r/min離心30 s，棄上清，再用1 mL NA液體培養(yǎng)基重懸。NA液體培養(yǎng)基稀釋菌液A600為0.3，37℃預(yù)熱，同時(shí)預(yù)熱MTT溶液和1.5 mL無菌離心管。取30 μL MTT溶液加入300 μL稀釋的菌液中，37℃孵育20 min。再加入3 mL 三聯(lián)液室溫放置過夜以溶解甲臜，4000 r/min離心5 min，小心取上清液掃描分光光度儀測(cè)定500～600 nm的吸光度值。

1.2.3 最佳菌濃度和MTT用量的確定

取A600為0.1、0.2和0.3的稀釋菌液各300 μL，分別加入5、10、20、30、40、50 μL的MTT，37℃孵育20 min，其它步驟同1.2.2，取100 μL上清液加入96孔板中，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，下同，測(cè)定512 nm的吸光度值。

1.2.4 最佳MTT反應(yīng)時(shí)間的確定

取A600為0.1、0.2和0.3的稀釋菌液各300 μL，加入30 μL MTT后，37℃分別孵育5、10、20、30、40和50 min，其它步驟同1.2.2，取100 μL上清液加入96孔板中，測(cè)定512 nm的吸光度值。

1.2.5 最佳三聯(lián)液用量的確定

取A600為0.3的稀釋菌液300 μL，加入30 μL MTT后，37℃孵育20 min，生成的甲臜再分別用1、2、3、4和5 mL三聯(lián)液溶解，其它步驟同1.2.2，取100 μL上清液加入96孔板中，測(cè)定512 nm的吸光度值。

1.2.6 三聯(lián)液溶解甲臜晶體時(shí)間的確定

取A600為0.3的稀釋菌液300 μL，加入30 μL MTT后，37℃孵育20 min，生成的甲臜再用3 mL三聯(lián)液分別溶解1、2、4、8和12 h，其它步驟同1.2.2，取100 μL上清液加入96孔板中，測(cè)定512 nm的吸光度值。

1.2.7 甲臜晶體在三聯(lián)液中的溶解性

取A600為0.3的稀釋菌液300 μL，取30 μL MTT溶液加入300 μL稀釋的菌液中，37℃孵育20 min，生成甲臜晶體10 000 r/min離心30 s，小心棄上清，使剩余液體不超過20 μL。生成的甲臜溶液分別取10、20、30、60、90和120 μL，各加入3 mL 三聯(lián)液室溫放置過夜以溶解甲臜，4000 r/min離心5 min，取100 μL上清液加入96孔板中，測(cè)定512 nm的吸光度值。

1.2.8 平板計(jì)數(shù)法驗(yàn)證MTT法檢測(cè)結(jié)果

取A600為0.3的稀釋菌液(經(jīng)平板計(jì)數(shù)細(xì)菌密度為2.0×108CFU/mL)于沸水煮5 min，得到青枯菌死菌懸液。將死菌在NA平板上劃線，28℃培養(yǎng)24～72 h，驗(yàn)證其致死效果。

分別取A600為0.3的稀釋活菌液300、250、200、150、100、50和0 μL于1.5 mL無菌離心管中，對(duì)應(yīng)加入0、50、100、150、200、250和300μL的上述死菌懸液，混勻后，各加入30μL MTT，37℃孵育20 min，再加入3 mL三聯(lián)液室溫放置過夜以溶解甲臜，4000 r/min離心5 min，取100 μL上清液加入96孔板中，測(cè)定512 nm的吸光度值。同時(shí)，各混勻的菌懸液分別進(jìn)行平板計(jì)數(shù)驗(yàn)證。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

SPSS 19.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長

圖1 MTT法測(cè)定青枯菌活性的掃描波長Figure 1 Scanning wavelength of Ralstonia solanacearum measured by MTT

圖1顯示，青枯菌與MTT反應(yīng)生成的甲臜晶體經(jīng)三聯(lián)液溶解后，在500～600 nm范圍內(nèi)最大吸收波長為512 nm。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇512 nm作為檢測(cè)生成甲臜的波長。

2.2 最佳菌濃度和MTT用量

當(dāng)菌濃度和MTT用量增加，生成的甲臜逐漸增多。當(dāng)A600為0.3的稀釋菌液加入的MTT超過30 μL時(shí)，甲臜的生成率突然降低(圖2)。原因在于MTT反應(yīng)期間，不溶于水的甲臜晶體沉積在菌體表面。因此，隨著反應(yīng)進(jìn)行，在脫氫酶系周圍，反應(yīng)空間更小，導(dǎo)致甲臜的生成率突然降低。所以本實(shí)驗(yàn)最佳MTT用量為30μL，菌液濃度A600為0.3。

青枯菌用新鮮的NA液體培養(yǎng)基稀釋到A600為0.3(△)、0.2(□)和0.1(◇)

圖2 MTT用量與吸光度值的關(guān)系
Figure 2 Relationship between MTT dosage and absorbance

2.3 最佳MTT反應(yīng)時(shí)間

圖3-A顯示，不同數(shù)量的青枯菌還原MTT，甲臜晶體在前20 min迅速生成，隨后生成緩慢。本研究的青枯菌被大致認(rèn)為是一個(gè)脫氫酶體系，在MTT還原反應(yīng)期間，不溶于水的甲臜晶體沉積在菌體表面。因此，隨著反應(yīng)進(jìn)行，在脫氫酶系周圍，反應(yīng)空間更小，MTT反應(yīng)時(shí)間超過20 min導(dǎo)致甲臜的生成率突然降低。圖3-B顯示A512的數(shù)值(在0.001～1.391)與菌體數(shù)量(A600在0.01～0.3)線性關(guān)系良好。因此，我們建議青枯菌應(yīng)被NA培養(yǎng)基稀釋到A600為0.01～0.3之間，MTT還原反應(yīng)控制在20 min以內(nèi)。

2.4 最佳三聯(lián)液用量

表1顯示，當(dāng)三聯(lián)液用量為3 mL，溶解的甲臜晶體最多，超過3 mL，甲臜晶體的溶解不再顯著增加，所以三聯(lián)液溶解甲臜晶體的最佳用量為3 mL。

2.5 最佳三聯(lián)液溶解甲臜晶體時(shí)間

由表2可以看出，當(dāng)三聯(lián)液處理8 h以內(nèi)，溶解時(shí)間越長，溶解的甲臜晶體越多，超過8 h，甲臜晶體的溶解不再顯著增加，所以三聯(lián)液溶解甲臜晶體的最佳時(shí)間為8 h，放置過夜即可。

2.6 甲臜在三聯(lián)液中的溶解性

圖4顯示A512的數(shù)值與甲臜溶液(10～120 μL)線性關(guān)系良好。因此，我們建議生成的甲臜溶液取10～120 μL之間為好。

A:MTT還原時(shí)間；B:MTT還原法的線性關(guān)系;青枯菌用新鮮的NA液體培養(yǎng)基稀釋到A600為0.3(△)、0.2(□)和0.1(◇)

圖3 MTT被青枯菌還原
Figure 3 MTT was reduced byRalstoniasolanacearum

圖4 甲臜的溶解效率Figure 4 The dissolution efficiency of formazan

表1三聯(lián)液用量Table 1 Dosage of triple solution

表2 三聯(lián)液溶解甲臜晶體的時(shí)間Table 2 Dissolving formazan time of triple solution

注：不同小寫字母表示不同時(shí)間處理之間差異顯著(P<0.05)

2.7 平板計(jì)數(shù)法驗(yàn)證MTT法檢測(cè)結(jié)果

MTT法檢測(cè)活菌時(shí)，活菌濃度與吸光度值成正比。表3顯示，體積相同(300 μL)時(shí)MTT法測(cè)定的青枯菌活菌數(shù)與吸光度值(A)成正比，線性關(guān)系良好(R2=0.9893)，平板計(jì)數(shù)法印證了這一結(jié)果。結(jié)果表明MTT法可以用于青枯菌的活菌檢測(cè)。

表3 平板計(jì)數(shù)法與MTT法檢測(cè)結(jié)果比較Table 3 Comparison of the method of plate counting and MTT method

3 討論

本研究是一種快速測(cè)定細(xì)菌MTT還原活性的改進(jìn)方法，MTT被幾種細(xì)胞脫氫酶催化成甲臜晶體，多數(shù)脫氫酶位于呼吸鏈[9-11]。因此，細(xì)菌的MTT還原反應(yīng)不僅與細(xì)菌生長期有關(guān)，還與溶氧水平或培養(yǎng)基組成有關(guān)[12]。換句話說，細(xì)菌MTT還原反應(yīng)通常被認(rèn)為是一種綜合的細(xì)胞電子傳遞效率指標(biāo)。我們的結(jié)果說明MTT在20 min內(nèi)被NA液體培養(yǎng)基里面的青枯菌反應(yīng)，形成不溶于水的甲臜晶體沉淀在菌體內(nèi)，MTT實(shí)驗(yàn)控制在30 min內(nèi)完成，結(jié)果更可靠。

通常，MTT測(cè)定細(xì)菌活力實(shí)驗(yàn)可以分成2個(gè)階段，即MTT還原反應(yīng)階段和甲臜晶體在有機(jī)溶劑中的溶解階段。許多對(duì)MTT實(shí)驗(yàn)的干擾研究集中在還原反應(yīng)階段，極少關(guān)注溶解階段[13-14]。有研究報(bào)道，細(xì)菌的液體培養(yǎng)基對(duì)MTT還原反應(yīng)的干擾非常有限[8]，本研究還發(fā)現(xiàn)生成甲臜晶體后離心與否不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，故本實(shí)驗(yàn)在MTT反應(yīng)生成甲臜后不需要離心，直接加入三聯(lián)液溶解甲臜即可。為了去除菌體本身的干擾，本實(shí)驗(yàn)用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值之前需進(jìn)行離心去除菌體。用MTT代替WST-5、WST-8和XTT更好，因?yàn)楹笳邔?dǎo)致更高的背景吸收[15]。

本實(shí)驗(yàn)以溶解性較強(qiáng)的三聯(lián)液取代傳統(tǒng)的DMSO(二甲基亞砜，有皮膚毒性)溶解甲臜，可以不必在生成甲臜后離心去除培養(yǎng)液，還可以去除其中的細(xì)菌蛋白等成分以避免沉淀造成干擾。同時(shí)在生成甲臜后，不需要?jiǎng)×艺鹗幰灾?DMSO溶解甲臜需要?jiǎng)×艺鹗?。該方法既簡化了操作，又提高了可靠性。