周煥新,王偉

(1.山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所,化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 太原 030006;2.太原科技大學(xué) 環(huán)境與安全學(xué)院，山西 太原 030024)

0 引言

金屬硫蛋白(Metallothioneins,MTs)是一類小的超家族胞漿蛋白,能夠通過半胱氨酸(Cys)殘基螯合重金屬離子[1],廣泛存在于微生物、植物、無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物的各種組織和器官[2]。MTs不僅參與重金屬離子的解毒[3],同時(shí)也參與必需金屬離子平衡調(diào)節(jié)[4],在細(xì)胞的氧化應(yīng)激、增殖、凋亡和衰老等一系列生理生化過程中發(fā)揮重要作用[5]。原生動(dòng)物嗜熱四膜蟲(Tetrahymenathermophila)包含5種金屬硫蛋白亞型,依據(jù)誘導(dǎo)物類型和Cys殘基排布模式被劃分為7a和7b兩個(gè)亞家族。7a亞家族的MTT1、MTT3和MTT5屬于鎘誘導(dǎo)型金屬硫蛋白(CdMT),7b亞家族的MTT2和MTT4屬于銅誘導(dǎo)型金屬硫蛋白(CuMT)。四膜蟲5種MTs基因的編碼序列均無內(nèi)含子,適應(yīng)細(xì)胞對(duì)逆境環(huán)境脅迫下基因表達(dá)的快速響應(yīng)[6-8]。

哺乳動(dòng)物MTs的表達(dá)受金屬應(yīng)答元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子(Metal-responsive transcription factor 1,MTF-1)的調(diào)控,當(dāng)細(xì)胞處于逆境環(huán)境時(shí),MTF-1作用于MTs基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域的金屬響應(yīng)元件(Metal response element,MRE)、抗氧化響應(yīng)元件(Antioxidant response element,ARE)、糖皮質(zhì)激素響應(yīng)元件(Glucocorticoid responsive elements,GRE)等實(shí)現(xiàn)對(duì)MTs基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控[9]。MTF-1含有高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)域,包含有6個(gè)Cys2His2鋅指結(jié)構(gòu)域以及3個(gè)轉(zhuǎn)錄激活區(qū):酸性區(qū)域、富含脯氨酸(Pro)區(qū)域和富含絲氨酸(Ser)及蘇氨酸(Thr)的區(qū)域[10]。在金屬離子應(yīng)激條件下,果蠅MTF-1結(jié)合MRE激活MTs基因的轉(zhuǎn)錄[2]。四膜蟲中存在多種進(jìn)化高度保守的含有鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子[11]。四膜蟲不同的MTs基因在應(yīng)激條件下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平存在差異。MTT1、MTT3和MTT5能夠被多種應(yīng)激條件所誘導(dǎo),并表現(xiàn)出相應(yīng)的特異性,MTT1和MTT5主要參與重金屬離子鎘和鉛的解毒,MTT3主要參與Zn2+的平衡調(diào)節(jié)[7],而MTT2和MTT4主要參與Cu+的代謝[12-13]。然而參與嗜熱四膜蟲中金屬離子誘導(dǎo)下的MTs基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子并不清楚,本研究基于四膜蟲基因組數(shù)據(jù)庫(http:∥www.ciliate.org),首次篩選鑒定了含有鋅指結(jié)構(gòu)域的基因ZFP1(TTHERM-01002770),通過同源重組敲除ZFP1基因,獲得ΔZFP1細(xì)胞株,初步分析了金屬離子脅迫下ZFP1敲除突變細(xì)胞中MTs基因的轉(zhuǎn)錄水平,為金屬離子誘導(dǎo)下的金屬硫蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

嗜熱四膜蟲B2086細(xì)胞株(Cornell University,The nationalTetrahymenaStock Center,http:∥tetrahymena.vet.cornell.edu/index.html)。酵母提取物、胰蛋白胨(英國OXOID公司)、EDTA 鐵鹽;氨芐青霉素、巴龍霉素(上海生工),鏈霉素、兩性霉素、葡萄糖(北京索萊寶科技有限公司);pMD18-T克隆試劑盒(TaKaRa公司);限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶和Dream TaqDNA聚合酶(Thermo公司);SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa公司);膠回收試劑盒(OMEGA公司),質(zhì)粒提取試劑盒(北京天根生化);引物合成和DNA 序列測(cè)序由上海生工完成。

1.2 嗜熱四膜蟲細(xì)胞培養(yǎng)

嗜熱四膜蟲于SPP培養(yǎng)基(1%胰蛋白胨(g/L),0.2%葡萄糖(g/L),1.0%酵母提取物(g/L),0.003% EDTA鐵鹽(g/L))中30℃,170 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)。

1.3 敲除載體構(gòu)建

以嗜熱四膜蟲大核基因組為模板,通過引物KO-ZFP1-5-F/KO-ZFP1-5-R和KO-ZFP1-3-F/KO-ZFP1-3-R分別擴(kuò)增ZFP1基因的上游序列876 bp和下游序列544 bp,PCR反應(yīng)條件為:94℃,5 min,94℃,30 s,52℃,30 s,72℃,90 s,30個(gè)循環(huán),72℃延伸 10 min。回收片段與pMD18-T載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,篩選獲得重組質(zhì)粒pMD18-ZFP1-5′和pMD18-ZFP1-3′。限制性內(nèi)切酶SacⅠ和NotⅠ分別酶切質(zhì)粒pMD18-ZFP1-5′和載體pNEO4并回收片段T4 DNA連接酶連接(16℃過夜),轉(zhuǎn)化并篩選獲得pZFP1-5′-NEO4質(zhì)粒。限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XhoⅠ分別酶切質(zhì)粒pMD18-ZFP1-3′和pZFP1-5′-NEO4,回收目的片段通過T4 DNA連接酶連接并轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,篩選獲得重組質(zhì)粒pN-ZFP1。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)化及突變株篩選

重組質(zhì)粒pN-ZFP1用限制性內(nèi)切酶SacⅠ和KpnⅠ酶切線性化,濃縮至1～1.5 μg/μL。通過基因槍(GJ-1000,寧波新芝科技有限公司)將線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到嗜熱四膜蟲細(xì)胞中。通過提高SPP培養(yǎng)基中巴龍霉素濃度進(jìn)行細(xì)胞表型分配的篩選。PCR對(duì)敲除株進(jìn)行鑒定,PCR反應(yīng)條件為:94℃,5 min;94℃,30 s,53℃,4 min,72℃,90 s,30個(gè)循環(huán);72℃延伸 10 min。

1.5 Cu2+和Cd2+脅迫下細(xì)胞的增殖

通過急性毒性試驗(yàn)測(cè)定Cu2+和Cd2+對(duì)突變細(xì)胞24 h半數(shù)最大效應(yīng)濃度(Concentration for 50% of maximal effect,EC50)。Cu2+處理的終濃度分別為:15、30、45、60、100和120 μmol/L;Cd2+處理的終濃度分別為:5、10、15、20、30和40 μmol/L.野生型細(xì)胞和突變細(xì)胞在30℃、170 r/min恒溫培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期(1×105cells/mL),吸取500 μL細(xì)胞分別轉(zhuǎn)至24孔培養(yǎng)板,加入新鮮SPP培養(yǎng)基至2 mL,不同金屬離子母液按濃度梯度分別加入培養(yǎng)孔,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,血球計(jì)數(shù)器記錄不同處理細(xì)胞密度計(jì)算抑制率,以金屬離子濃度對(duì)數(shù)值和抑制率進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合,得到劑量-效應(yīng)曲線和EC50。

1.6 MTs基因的表達(dá)分析

ΔZFP1細(xì)胞和野生型細(xì)胞在53.0 μmol/L CuSO4和25.3 μmol/L CdCl2誘導(dǎo)1 h后,不同處理的突變細(xì)胞和野生型細(xì)胞mRNA分別被提取,分光光度計(jì)檢測(cè)所提取的mRNA的OD260/280在1.8～2.0之間,以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄PCR獲得cDNA。以野生型細(xì)胞為對(duì)照,對(duì)突變細(xì)胞中的MTs基因在不同金屬離子壓力下的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析,17S rRNA作為內(nèi)參,RT-PCR反應(yīng)條件為:95℃,15 min,95℃,15 s,56℃,30 s 40個(gè)循環(huán)。每個(gè)獨(dú)立的樣本采取3個(gè)平行,結(jié)果通過儀器自帶的StepOne Software讀取,采用2-ΔΔCT處理法進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)上采用T檢測(cè),P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 本研究中使用的PCR引物

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 嗜熱四膜蟲ZFP1基因分析

嗜熱四膜蟲ZFP1基因全長(zhǎng)2 160 bp,編碼 719個(gè)氨基酸(圖1C),N端包含4個(gè)B-Box鋅指結(jié)構(gòu)域,分別為F1、F2、F3和F4(圖1A),每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域由相應(yīng)的“l(fā)inker”鏈接,C端富含絲氨酸(Ser)區(qū)域共包含43個(gè)Ser,谷氨酰胺(Gln)富含區(qū)域共包含51個(gè)Gln(圖1C),SWISS-MODEL(https:∥www.swissmodel.expasy.org)模擬的Zfp1(19-134aa)三級(jí)結(jié)構(gòu)具有四個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域(圖1B)?；谒哪はx基因組數(shù)據(jù)庫(http:∥www.ciliate.org)分析,Zfp1與四膜蟲T.malaccesis,T.ellittti,T.borealis中的同源基因的一致性為73%、62%和51%。而鋅指結(jié)構(gòu)域的一致性為98%、89%和85%。通過四膜蟲功能基因組數(shù)據(jù)庫(http:∥tfgd.ihb.ac.cn)分析,ZFP1在生長(zhǎng)期有著較低的表達(dá)量,在饑餓期表達(dá)上調(diào),在有性生殖時(shí)期4 h達(dá)到最大值(圖2A)。野生型細(xì)胞在Cu2+誘導(dǎo)下,ZFP1轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)2.9倍,在Cd2+誘導(dǎo)下,ZFP1轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)1.4倍(圖2B),表明ZFP1響應(yīng)金屬離子的調(diào)控。

Fig.1 Sequence analysis of Zfp1 from T. thermophilaA:Zfp1鋅指結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)構(gòu)域,Zfp1包含4個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域,每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域由相應(yīng)的連接序列鏈接,C端包含富含絲氨酸和谷氨酰胺的結(jié)構(gòu)域。B:SWISS-MODEL模擬的Zfp1三級(jí)結(jié)構(gòu)圖。C:Zfp1氨基酸序列分析。圖1 嗜熱四膜蟲Zfp1的序列分析

Fig.2 Transcriptional expression analysis of ZFP1A:ZFP1基因的微陣列表達(dá)譜,L1為生長(zhǎng)期的表達(dá)水平;S0、S6、S9、S15和S24為饑餓0 h、6 h、 9 h、 15 h和24 h的表達(dá)水平;C0、C4、C8和C12為有性生殖0 h、4 h、8 h和12 h的表達(dá)水平。B:金屬離子Cd2+ 和Cu2+誘導(dǎo)下的ZFP1轉(zhuǎn)錄水平分析。圖2 ZFP1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

2.2 ΔZFP1突變細(xì)胞株的鑒定

通過同源重組方法獲得的ΔZFP1細(xì)胞(圖3A),在含有巴龍霉素的SPP培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。以ΔZFP1基因組為模板,ZFP1-F和ZFP1-R擴(kuò)增獲得3.4 kb重組片段;WT基因組為模板,獲得3.9 kb片段(圖3B)。qRT-PCR檢測(cè)ΔZFP1細(xì)胞中ZFP1的表達(dá),結(jié)果表明ZFR1無轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生,獲得ZFP1基因完全敲除的突變細(xì)胞(圖3C)。

Fig.3 Construction and identification of ΔZFP1 cellsA:ZFP1基因敲除同源重組示意圖。B:ΔZFP1細(xì)胞重組位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳,M:DNA 標(biāo)準(zhǔn),野生型條帶大約3.9 kb,重組條帶大約3.4 kb。C:ZFP1基因轉(zhuǎn)錄水平的qRT-PCR分析。圖3 ΔZFP1突變細(xì)胞株的構(gòu)建和鑒定

2.3 ZFP1的敲除影響細(xì)胞對(duì)Cu2+和Cd2+的耐受性

為了分析ZFP1是否參與細(xì)胞對(duì)金屬離子的耐受性,以Cu2+和Cd2+對(duì)野生型細(xì)胞和ΔZFP1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制進(jìn)行了測(cè)定。野生型細(xì)胞對(duì)Cu2+和Cd2+的EC50值分別為83.1 μmol/L和32.8 μmol/L;ΔZFP1細(xì)胞對(duì)Cu2+和Cd2+的EC50值分別為53.0 μmol/L和25.3 μmol/L(圖4),表明ΔZFP1對(duì)Cu2+和Cd2+耐受性降低,說明敲除ZFP1基因影響了細(xì)胞對(duì)銅、鎘的耐受性。

Fig 4 Inhibition of ΔZFP1 cells growth under Cu2+和Cd2+ stress野生型細(xì)胞和ΔZFP1細(xì)胞暴露在含有CuSO4或CdCl2脅迫下的增值。A:野生型細(xì)胞和ΔZFP1細(xì)胞暴露在含有CuSO4的SPP培養(yǎng)基中的EC50值分別為83.1 μmol/L和53.0 μmol/L。B:野生型細(xì)胞和ΔZFP1細(xì)胞暴露在含有CdCl2的SPP培養(yǎng)基中的EC50值分別為32.8 μmol/L和25.3 μmol/L。圖4 Cu2+和Cd2+抑制ΔZFP1細(xì)胞的增殖

2.4 Cu2+和Cd2+離子脅迫下MTs的轉(zhuǎn)錄分析

哺乳動(dòng)物MTF-1缺失的突變體中,MTs基因的表達(dá)顯著下調(diào)[14]。在Cu2+誘導(dǎo)下,ΔZFP1細(xì)胞中MTT2、MTT3、MTT4和MTT5的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低(p<0.01),而MTT1的轉(zhuǎn)錄水平升高(P<0.01)(圖5A),表明ZFP1基因參與了Cu2+誘導(dǎo)的MTT2、MTT3、MTT4和MTT5的表達(dá)。Cd2+誘導(dǎo)下,ΔZFP1中僅發(fā)現(xiàn)MTT4轉(zhuǎn)錄水平顯著降低(P<0.01)而MTT3和MTT5(P<0.01),MTT1和MTT2(P<0.05)表達(dá)上調(diào)(圖5B),表明ZFP1基因可能并不直接參與Cd2+誘導(dǎo)下MTT1、MTT2、MTT3和MTT5基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

Fig.5 Transcription level of MTs induced by Cu2+ and Cd2+ in ΔZFP1 cellsA:ΔZFP1細(xì)胞在含有CuSO4培養(yǎng)基中的MTs的表達(dá)分析。B:ΔZFP1細(xì)胞在含有CdCl2的SPP培養(yǎng)基中的MTs的表達(dá)分析。圖5 Cu2+和Cd2+誘導(dǎo)下ΔZFP1細(xì)胞中MTs基因轉(zhuǎn)錄水平

3 討論

MTs基因表達(dá)受多種應(yīng)激條件的影響,如金屬離子、甾體類激素、化學(xué)物質(zhì)、納米材料、炎癥等[1,5]。MTs基因轉(zhuǎn)錄受MTF-1的調(diào)控,在金屬離子誘導(dǎo)下,MTF-1中的鋅指結(jié)構(gòu)與MTs基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的MRE結(jié)合,響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)游離Zn2+濃度調(diào)節(jié),從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核實(shí)現(xiàn)與DNA結(jié)合完成轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[15-16]。在哺乳動(dòng)物中MRE大多以多拷貝形式存在,并且表現(xiàn)為特有的固定核心序列“TGCRCNC”其中R=A/G,N=A/T/C/G[17]。在嗜熱四膜蟲基因表達(dá)調(diào)控元件中鑒定出金屬硫蛋白保守基序(Metallothionein Conserved Motif 1,MTCM1)的順式調(diào)控元件,包含一個(gè)TGANTCA(N為任意核酸)序列,這種順式作用元件類似于釀酒酵母中從事拮抗金屬和氧化應(yīng)激作用的YAP-1和c-jun的應(yīng)答元件(TGAG/CTCA)[18-19]。這種保守基序MTCM1在MTT1調(diào)控序列中出現(xiàn)6次,MTT3調(diào)控序列中出現(xiàn)2次,MTT5調(diào)控序列中出現(xiàn)13次,MTT2調(diào)控序列中出現(xiàn)1次,MTT4調(diào)控序列中出現(xiàn)3次[20]。相應(yīng)的MTT5基因在Cd的脅迫下表達(dá)水平最高,MTT1次之,而MTT3最低;Cu的脅迫下,MTT4的表達(dá)水平顯著高于MTT2[8]。哺乳動(dòng)物MTF-1調(diào)控了控制金屬離子濃度動(dòng)態(tài)平衡和抗氧化反應(yīng)的基因的表達(dá)[21]。敲除MTF-1的突變小鼠對(duì)鎘離子的毒性更加敏感[22]。嗜熱四膜蟲中存在多種進(jìn)化高度保守的含有鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子,并且發(fā)揮著不同功能,Zfr1p在性發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控功能[11]。本研究中嗜熱四膜蟲缺失ZFP1基因,生長(zhǎng)發(fā)育未受到影響,表明ZFP1與生長(zhǎng)發(fā)育無關(guān)。但是ΔZFP1細(xì)胞表現(xiàn)為對(duì)金屬離子的耐受性降低,這一結(jié)果與我們先前研究的缺失MTs基因影響細(xì)胞對(duì)金屬離子的耐受性的結(jié)果相類似,先前的研究表明敲除MTT2和MTT4基因,導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)Cu2+的耐受性降低[23],敲除MTT1,MTT3,或MTT5基因?qū)Ъ?xì)胞對(duì)Cd2+耐受性降低[23-24]。而敲除ZFP1基因的突變細(xì)胞表現(xiàn)為Cu2+和Cd2+耐受性降低,說明ZFP1的缺失影響了細(xì)胞對(duì)金屬離子的耐受性。

在大多數(shù)生物中,多種MT異構(gòu)體存在是一個(gè)普遍現(xiàn)象,并且不同MT異構(gòu)體表現(xiàn)出不同的功能。在同樣的脅迫條件下,不同的異構(gòu)體具有不同響應(yīng)程度,表明這些MT異構(gòu)體具有不同的調(diào)控機(jī)制[20]。金屬離子誘導(dǎo)ΔZFP1細(xì)胞發(fā)現(xiàn),在Cu2+誘導(dǎo)下,MTT2、MTT3、MTT4和MTT5轉(zhuǎn)錄水平降低(圖5A),ZFP1基因缺失影響了MTs的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,表明Zfp1與Cu2+脅迫下MTT2、MTT3、MTT4和MTT5轉(zhuǎn)錄相關(guān),而MTT1轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)暗示可能存在其他特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子補(bǔ)償了細(xì)胞缺失ZFP1所導(dǎo)致的MTs基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)(圖5A)。ΔZFP1細(xì)胞在Cd2+誘導(dǎo)下MTT1、MTT2、MTT3和MTT5轉(zhuǎn)錄水平上調(diào),表明ZFP1可能并不直接參與Cd2+脅迫下四膜蟲CdMT(MTT1、MTT3和MTT5)和MTT2的轉(zhuǎn)錄,暗示四膜蟲MTs基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控存在多種調(diào)節(jié)因子,但是,ZFP1缺失導(dǎo)致突變體細(xì)胞在Cd2+誘導(dǎo)下,MTT4的表達(dá)顯著降低。因此我們推測(cè)四膜蟲金屬離子誘導(dǎo)下的MTs轉(zhuǎn)錄調(diào)控是一個(gè)由多因子共同參與調(diào)控的過程,同時(shí)單一的鋅指結(jié)構(gòu)蛋白也可能參與不同MTs基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。