岳拴琴,任竹梅

(山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山西 太原 030006)

0 引言

五倍子蚜特指寄生在漆樹科鹽膚木屬(Rhus)植物上形成五倍子蟲癭的一類蚜蟲,屬于昆蟲綱半翅目蚜總科綿蚜亞科(Eriosomatinae)五節(jié)根蚜族(Fordini),共有6屬12種,除北美(加拿大和美國)分布一單屬種北美五倍子蚜(Melaphisrhois)外,其余物種都分布在東亞。五倍子具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值,在醫(yī)藥上作為傳統(tǒng)中藥的有效成分,具有斂肺、止汗、澀腸、固精、止血和解毒等作用;在國防化工上是皮革鞣劑、噴氣飛機(jī)燃料的穩(wěn)定劑中的重要成分,在食品上可用于食品抗氧化劑、油脂抗氧化劑的制備等[1]。1866年,Fitch[2]報(bào)道在北美Virginia采集到Rhusglabra上的蟲癭,并將寄生在其中的蚜蟲定名為Byrsocryptarhois,后來諸多學(xué)者[3-4]相繼對該物種進(jìn)行了修訂和歸類。直到1976年,Eastop和Lambers[5]才將該物種確立為M.rhois。隨后,許多學(xué)者對其進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育研究,龐雅文等[6]采用形態(tài)特征分析結(jié)合線粒體DNA(mtDNA)COI基因序列對該種的分類地位和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究,發(fā)現(xiàn)M.rhois和倍蚜屬的關(guān)系密切;安淼等[7]測定了五倍子蚜mtDNACOI、tRNA/COII、Cytb基因以及核DNAEF-1α基因部分序列,數(shù)據(jù)分析結(jié)果支持M.rhois起源于東亞,東亞是五倍子的發(fā)源地。Hebert[8]采用等位酶分析方法研究采自加拿大安大略和魁北克兩個(gè)地區(qū)34個(gè)M.rhois種群的遺傳多樣性,結(jié)果顯示M.rhois種群的遺傳變異較小,種群間基因交流少;張健等[9]采用mtDNACOI基因序列對M.rhois3個(gè)種群的遺傳變異進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)種群間遺傳變異較大,有待進(jìn)行更深層次的系統(tǒng)研究。

遺傳多樣性是生物長期演化的結(jié)果,可以全面反映物種對環(huán)境適應(yīng)能力的大小。遺傳多樣性本質(zhì)上是由于遺傳物質(zhì)發(fā)生改變導(dǎo)致的,突變是遺傳物質(zhì)發(fā)生變化的根本原因,經(jīng)過長期的自然選擇且有一些中性突變通過隨機(jī)組合整合到基因組中,可產(chǎn)生豐富的遺傳多樣性[12]。如果一個(gè)物種遺傳多樣性越高,越容易在惡劣環(huán)境中生存下來,尤其更有利于擴(kuò)大該物種的生存環(huán)境和增加種群的數(shù)量,反之可能有瀕?；蛘邷缃^的危險(xiǎn)[10-11]。

mtDNA是研究屬級及其以下階元較為理想的DNA片段,其中Cytb基因是一種蛋白質(zhì)編碼基因,是目前功能和結(jié)構(gòu)研究最清楚的基因之一,進(jìn)化速度較快,已被廣泛地應(yīng)用于分子系統(tǒng)學(xué)研究[13]。COI基因是細(xì)胞色素C氧化酶的重要組成部分,在線粒體基因中是最保守的,進(jìn)化速率最慢的已被廣泛用于昆蟲遺傳多樣性研究中,分析不同類群的種群遺傳變異和分化[14]。為此,本研究以Melaphisrhois為研究對象,測定其mtDNACytb和COI基因部分序列,對其遺傳變異和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,為更好地保護(hù)和合理開發(fā)利用這一重要生物資源提供分子生物學(xué)遺傳資料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用五倍子蚜實(shí)驗(yàn)材料均采自美國自然種群,具體信息見表1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取和PCR擴(kuò)增

將一個(gè)五倍子蚜個(gè)體置于1.5 mL EP管中,加入適量無菌水浸泡至少24 h后采用硅膠離心柱法提取總DNA;PCR擴(kuò)增mtDNACytb和COI基因部分序列,因COI基因片段較長,我們采用兩對引物進(jìn)行擴(kuò)增拼接,所用引物均由上海生物工程有限公司合成[15-17]。PCR擴(kuò)增體系和循環(huán)程序參考文獻(xiàn)[6]。

1.2.2 測序和數(shù)據(jù)分析

將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生物工程有限生物公司進(jìn)行雙向測序,利用Chromos軟件對測得的序列進(jìn)行觀察,用Sequencher4.5[18]參照序列彩圖進(jìn)行人工校對;用Clustal-X v1.83軟件[19]對所得序列進(jìn)行對位排列;利用MEGA5.0[20]計(jì)算核苷酸變異率;利用DnaSP5.0軟件[21]計(jì)算種群間遺傳距離和單倍型分布等;Arlequin v3.0.1軟件[22]計(jì)算種群內(nèi)和種群間遺傳變異,以檢測地理種群內(nèi)和種群間的變異程度;TCS v1.21[23]構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。

表1 Melaphis rhois種群樣本信息及mtDNA Cytb和COI基因單倍型和核苷酸多樣性指數(shù)

2 結(jié)果和分析

2.1 堿基組成及變異

本研究共獲得美國五倍子蚜9個(gè)種群156個(gè)樣本的mtDNACytb429 bp和COI基因1 245 bp的序列,序列已經(jīng)全部提交到GenBank,Cytb基因收錄號:MH256861-MH257018,COI基因收錄號:MH257019-MH257182。

聯(lián)合基因序列長1 674 bp,其中保守位點(diǎn)1 482個(gè)(占88.5%)、變異位點(diǎn)192個(gè)(占11.5%)、簡約信息位點(diǎn)162個(gè)(占9.7%)、單一信息位點(diǎn)30個(gè)(占1.8%),堿基A+T含量比G+C高(為74.7%),其中第3位點(diǎn)A+T的含量與其他位點(diǎn)相比最高(為88.8%),si/sv比為8.61。聯(lián)和序列堿基組成和變異率見表2。

表2 Melaphis rhois mtDNA Cytb和COI基因聯(lián)合序列堿基組成和序列變異

2.2 單倍型分布

mtDNACytb和COI基因序列共獲得86個(gè)單倍型(表1),包括8個(gè)共享單倍型和78個(gè)獨(dú)享單倍型,其中單倍型M16和M20分別為阿肯色州和佐治亞州種群所獨(dú)享,M45為俄亥俄州代頓和紐約州2個(gè)種群共享,單倍型M60為紐約州、新罕布什爾州、佛蒙特州3個(gè)種群共享,這4個(gè)單倍型屬于主要的類型,分別占單倍型的5.81%、5.16%、5.16%和7.1%。

2.3 種群遺傳變異和遺傳結(jié)構(gòu)

五倍子蚜9個(gè)自然種群mtDNACytb和COI基因聯(lián)合序列的單倍型多樣性(Hd)指數(shù)以及核苷酸多樣度(π)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1,數(shù)據(jù)分析顯示新罕布什爾州種群單倍型多樣性指數(shù)最高,阿肯色州種群最低;新澤西州種群核苷酸多樣性指數(shù)最高,俄亥俄州克利夫蘭種群最低。

五倍子蚜9個(gè)自然種群mtDNACytb和COI基因聯(lián)合序列FST值和遺傳距離結(jié)果見表3。

表3中數(shù)據(jù)表明:俄亥俄州克利夫蘭種群與其余8個(gè)種群間的FST值(0.788 39～0.985 55)及遺傳距離(0.044～0.057)較高,發(fā)現(xiàn)該種群與其它種群相比分化較大。

對五倍子蚜9個(gè)種群的mtDNACytb和COI基因聯(lián)合序列進(jìn)行AMOVA分析,結(jié)果顯示種群間的變異為59.53%,種群內(nèi)的變異為40.47%,種群間的變異高于種群內(nèi)的變異。

表3 五倍子蚜種群mtDNA Cytb和COI聯(lián)合基因序列間FST(左下)和遺傳距離(右上)

2.4 譜系地理分布格局

構(gòu)建五倍子蚜種群的mtDNACytb和COI基因單倍型TCS網(wǎng)絡(luò)圖,結(jié)果見圖1。

從圖中可以看出,network中有五大明顯的簇群,其中俄亥俄州克利夫蘭種群的所有單倍型與俄亥俄州代頓種群的單倍型M15形成一個(gè)組;密蘇里州種群中單倍型M11單獨(dú)形成一個(gè)組;總體來看剩余種群基本上因寄主植物不同聚成三大簇群,佐治亞州、阿肯色州種群單獨(dú)成支,俄亥俄州代頓、密蘇里州、紐約州、新澤西州、新罕布什爾州、佛蒙特州種群呈一種交叉的分布格局,單倍型M20、M45、M68分別位于三大簇群的中心位置。

五倍子蚜種群的mtDNACytb和COI基因聯(lián)合序列單倍型歧點(diǎn)分布見圖2。

Fig.2 Bifurcation point distribution of Melaphis rhois based on mtDNA Cytb and COI sequences注:虛線為觀察值,實(shí)線為期望值圖2 Melaphis rhois mtDNA Cytb和COI聯(lián)合基因單倍型歧點(diǎn)分布圖

中性檢測五倍子蚜mtDNACytb和COI基因聯(lián)合序列的Tajima’D值(0.912 03)為正(表1),并且單倍型歧點(diǎn)分布呈多峰型,說明M.rhois可能在歷史上長期處于動(dòng)態(tài)平衡之中。

3 討論

遺傳多樣性中單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(π)是衡量物種遺傳多樣性的重要指標(biāo),通常值越大,物種種群遺傳多樣性越高。在本研究中,五倍子蚜種群總體π值為0.027 00,與角倍蚜(Schlechtendaliachinensis,0.002 70)[24]、肚倍蚜(Kaburagiarhusicola,0.015 15)[25]、倍花蚜(Nurudea.shiraii,0.005 7)和紅倍花蚜(Nurudeayanoniella,0.012 6)[26]等相比,核苷酸多樣性相對較高,遺傳多樣性較豐富。估計(jì)種群的進(jìn)化歷史通常用單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(π),當(dāng)Hd≥0.5,π<0.5%時(shí),表明種群受瓶頸效應(yīng)后數(shù)量迅速擴(kuò)張;當(dāng)Hd≥0.5,π≥0.5%時(shí),表示種群穩(wěn)定,進(jìn)化歷史悠久;當(dāng)Hd<0.5,π≥0.5%時(shí),表明種群經(jīng)歷了輕微的瓶頸效應(yīng),幾乎沒有影響到核苷酸變異;當(dāng)Hd<0.5,π<0.5%時(shí),表明種群近期經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng)[27]。五倍子蚜種群整體的Hd≥0.5,π≥0.5%,說明種群穩(wěn)定,進(jìn)化歷史悠久,該結(jié)果與中性檢測結(jié)果相吻合,mtDNACytb和COI基因聯(lián)合序列的中性檢測Tajima’D值(0.912 03)為正,單倍型歧點(diǎn)分布呈多峰型,說明五倍子蚜可能在歷史上長期處于動(dòng)態(tài)平衡之中[28]。另外,北美五倍子蚜阿肯色州種群的Hd值較高(Hd≥0.5),π值較低(π<0.5),是由于在積累時(shí)間上核苷酸多樣性比單倍型需要的時(shí)間長,說明這些種群是從較小的種群迅速擴(kuò)張而來[29]。

五倍子蚜因生活環(huán)境的不同,而產(chǎn)生不同程度的遺傳分化。遺傳分化指數(shù)FST是衡量種群遺傳分化的一個(gè)重要指標(biāo)。通常,FST的理論取值范圍應(yīng)為0～1,FST值越接近0,說明種群間遺傳分化程度越小;FST值越接近1,說明種群間遺傳分化程度越大;若FST=1.00,則種群間已形成生殖隔離[30]。五倍子蚜俄亥俄州克利夫蘭種群與其余8個(gè)種群間的FST值(0.788 39～0.985 55)較高,說明該種群與其他種群的分化較大。AMOVA結(jié)果表明種群間的變異是遺傳變異的主要來源。造成分化的可能原因是種群分布的地理位置不同造成地理隔離,而生殖隔離隨地理隔離產(chǎn)生,使得不同地理種群的北美五倍子蚜之間發(fā)生分化。

結(jié)合TCS網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)五倍子蚜種群聯(lián)合序列86個(gè)單倍型形成5個(gè)大的聚類簇,而俄亥俄州克利夫蘭種群全部單倍型與代頓種群一個(gè)單倍型聚為一組;結(jié)合種群間的FST值以及遺傳距離分析,推測其可能是五倍子蚜的一個(gè)新種。

五倍子蚜的種群和樣本數(shù)量也可能對結(jié)果有一定的影響,而且生物的進(jìn)化是一個(gè)極其復(fù)雜的過程,應(yīng)結(jié)合形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)、古生物學(xué)等多種方法進(jìn)行綜合研究。下步研究中,我們將擴(kuò)大種群的采集范圍、增加種群數(shù)量和基因序列信息量進(jìn)行深入探討。