陳文鳳，郭雅玲

（福建農(nóng)林大學 園藝學院，福建 福州 350002）

烏龍茶是六大茶類之一，以其天然濃郁的花果香型和醇厚回甘的品種韻味有別于其他茶類，兼具綠茶的清爽高香和紅茶的鮮濃醇厚，素以滋味醇厚、花香濃郁、品種繁多而聞名天下，有著“茶中香檳”的美譽。其制作工序為：攤青、做青、殺青、揉捻、包揉、干燥。做青是形成烏龍茶獨特品質的關鍵工序，也是奠定烏龍茶獨特香氣和滋味的基礎。

做青是搖青和靜置交替進行的過程，做青過程相當于機械伴隨水分脅迫的逆境條件，植物在逆境條件下體內(nèi)發(fā)生一系列的生理生化變化[1]。做青引起的機械損傷以及水分的適度散失，一方面刺激了細胞內(nèi)各種內(nèi)含物的轉化，另一方面也為離體葉片營造了一個逆境環(huán)境，促使細胞內(nèi)發(fā)生微妙的變化，如細胞膜透性改變、多酚類物質氧化、物質水解、脂質降解、葉綠素破壞等，這些變化為烏龍茶獨特品質的形成奠定基礎[2]。

做青葉細胞內(nèi)部的研究主要集中在做青過程中細胞結構變化、酶活性變化、脂質過氧化等[3-4]；近幾年，隨著茶樹分子生物學的快速發(fā)展，也展開了對烏龍茶做青葉片內(nèi)部的分子機制的初步研究[5]。

1 烏龍茶葉片結構的獨特性

制作茶葉，必須要講究茶鮮葉的適制性，制作烏龍茶的鮮葉要求表面角質層和蠟質層要厚，防止搖青后出現(xiàn)死青。嚴學成[6]對烏龍茶不同葉位的葉片進行超微結構觀察，發(fā)現(xiàn)適制烏龍茶的茶樹品種鮮葉特征為：從芽下第一葉到第四葉，葉片內(nèi)的葉綠體結構逐漸發(fā)生分化、葉綠體片層增多，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量呈遞增趨勢，第三葉的葉綠體出芽產(chǎn)生原生質體，并指出適制烏龍茶各品種的成熟葉普遍存在葉綠體出芽產(chǎn)生原生質體的現(xiàn)象，這是適制烏龍茶鮮葉有別于適制其他茶類鮮葉的特性。

2 做青葉細胞內(nèi)部結構變化

做青期間葉片發(fā)生碰撞，使葉片細胞組織損傷與器官發(fā)生變化。黃曉敏[7]對烏龍茶鮮葉與做青葉葉片顯微結構進行比較研究，發(fā)現(xiàn)與鮮葉相比，做青葉片有水紋狀皺縮，葉脈下陷，葉表面粗糙，上表皮角質層不清晰，下表皮細胞不完整，海綿組織更加疏松，表明做青使鮮葉內(nèi)部結構發(fā)生變化。

3 做青葉細胞酶的變化

做青的目的是讓葉片內(nèi)發(fā)生適度的酶促氧化，促進做青葉內(nèi)部物質轉化與積累，逐步形成花香馥郁、滋味醇厚的內(nèi)質和綠葉紅邊的葉底。做青葉內(nèi)的酶活性與做青程度密切相關，做青過程中的內(nèi)源酶活性直接影響成品茶品質特征[8-9]。

3.1 氧化還原酶類

多酚氧化酶（PPO）和過氧化物酶（POD）是烏龍茶加工過程中重要的氧化還原酶類。

禹利君等[10]初步探明了烏龍茶做青葉片內(nèi)POD 和PPO 的變化規(guī)律，整葉中的PPO 活性在做青過程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而POD活性則呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢；整葉、葉緣、葉芯這三者的PPO 和POD 活性變化規(guī)律不同，且PPO 與POD 的變化規(guī)律是相反的。黃福平等[11]進一步推測了做青前期PPO 活性的增加并未明顯導致多酚類物質下降的原因是做青前期細胞破損率和膜透性都很低，而在做青后期細胞質膜通透性增加，使細胞內(nèi)的酶與底物充分接觸，促進多酚類物質氧化；并發(fā)現(xiàn)細胞質膜透性過度加大會造成多酚類物質與蛋白質聚合沉積，不利于烏龍茶良好品質的形成，指出以不導致做青葉細胞質膜通透性急劇增大，引起多酚類物質顯著下降為烏龍茶做青適度的生化指標之一。

王爾茂等[12]進行了不同做青方式對內(nèi)源酶的影響研究，發(fā)現(xiàn)POD、PPO 和SOD 活性變化趨勢較一致，總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，做青結束時POD 和PPO 的活性均高于做青前的活性，且手工搖青葉的酶活性顯著低于機械搖青葉的酶活性；SOD 的活性的變化雖然也是先上升后下降的趨勢，但是做青結束后的酶活性要低于做青前時的活性，這是因為做青葉細胞受到外力的脅迫使SOD 活性上升以清除自由基，但隨著搖青次數(shù)的增加，自由基大量上升，導致SOD 活性下降。他指出做青使細胞膜結構遭到破壞，酶與底物的接觸程度影響著茶多酚氧化和其他生化反應的程度，表明做青應講究做青適度，過度做青不利于良好品質的形成。

陳敏星[13]也研究了做青過程中做青葉片的PPO、POD 的活性變化，發(fā)現(xiàn)做青葉POD 活性在四搖前一直上升并達到最大，但到做青結束時活性降低，猜測可能是由于做青葉的含水率較低導致的；PPO 活性呈下降上升下降上升的“W”型變化；做青后PPO 和POD 的活性均高于做青前，這與前人研究結果一致。

3.2 水解酶類

3.2.1 蛋白酶

蛋白酶是一種內(nèi)源水解酶，可將茶葉中的蛋白質水解成各種氨基酸[14]。王若仲等[15]研究發(fā)現(xiàn)做青可增加葉片內(nèi)蛋白酶的活性，使葉片內(nèi)的可溶性蛋白和氨基酸含量增加。做青前中期，蛋白酶活性葉緣＞整葉＞葉芯；做青結束時，蛋白酶活性葉緣＞葉芯＞整葉。通過做青工藝，適當?shù)恼{(diào)控蛋白酶活性，將有利于可溶性蛋白和游離氨基酸的適度積累，促進烏龍茶優(yōu)良品質的形成。

3.2.2 果膠酶

果膠酶的主要作用是分解植物組織細胞壁和細胞間的果膠物質，進而使細胞壁解體并增加細胞間的通透性，促進植物組織呼吸作用和物質代謝[16]。唐顥[17]對金萱和白葉單樅做青過程中內(nèi)源果膠酶活性的動態(tài)變化進行研究，結果表明：搖青處理酶活性顯著高于不搖青處理，搖青前期酶活性逐漸增強，在第三次搖青結束時達到峰值，且可溶性糖的含量在此期間積累，使得葉質變軟，降低了做青葉之間的摩擦強度，保證做青葉能夠順利“走水”，為后續(xù)的可溶性糖的轉化保留以及其他品質生化成分的保留奠定物質基礎。此后的第四、五次搖青酶活性迅速下降，可能與在制品內(nèi)含物轉化和呼吸代謝有關。

3.2.3 β-葡萄糖苷酶

β-葡萄糖苷酶是烏龍茶香氣前體物質釋放過程中的一種重要水解酶，其活性的變化直接影響著制茶品質尤其是香氣品質的形成[18-21]。張秀云[22]等研究了萎凋做青過程中β-葡萄糖苷酶活性的變化，結果表明，萎凋做青期間β 葡萄糖苷酶活性呈盤峰變化趨勢，做青結束前約2 h達到整個做青過程的巔峰值；做青后期，β-葡萄糖苷酶活性下降，推測可能是因為在臨近做青結束時，茶鮮葉失水較多、細胞膜透性增大、多酚類物質的酶促氧化作用增強，氧化還原酶的強活性抑制了水解酶的活性，導致β-葡萄糖苷酶活性降低。陳藝元[23]也對搖青工藝中的酶活性進行了研究，發(fā)現(xiàn)搖青可以提高酶的活性，機械力使細胞內(nèi)的液泡損傷，促進液泡中的糖苷類前體與β-葡萄糖苷酶接觸，酶活性的峰值出現(xiàn)在第一次和第二次搖青完成時，隨后晾青過程中活性下降，此研究結果與張秀云的研究結果基本一致。吳喬[24]等的研究結果表明，β-葡萄糖苷酶的活性在低溫（17℃）條件下被抑制；高溫（27℃）雖然能促進β-葡萄糖苷酶活性的增加，但葉片內(nèi)呼吸作用的增強會增加內(nèi)含物質的消耗，不利于烏龍茶良好品質的形成；室溫22℃不僅能增加酶活性，而且也能保證做青的品質。做青引起的機械損傷以及水分的適度散失，一方面刺激了細胞內(nèi)各種內(nèi)含物質的轉化，提高了β-葡萄糖苷酶的活性；另一方面，這種損傷不至于造成細胞死亡，反而通過搖青的“走水還陽”作用維持了細胞的活力，使細胞內(nèi)的物質轉化和呼吸作用得到合理控制。

3.2.4 纖維素酶

纖維素酶可使細胞壁降解，從而促進細胞間的物質、水分轉運和酶促反應進行。唐顥等[25]對做青期間纖維素酶活性進行研究，發(fā)現(xiàn)做青葉纖維素酶活性高于不做青葉纖維素酶活性，做青葉在二搖前，纖維素酶活性上升快，且可溶性糖含量增加，但隨著搖青次數(shù)的增加，纖維素酶活性減弱，這可能是由于細胞受損增加，多酚類物質增多，產(chǎn)生的蛋白質沉淀增加，導致酶活性下降。可以推斷做青前期，纖維素酶活性的增加為可溶性糖的積累提供物質基礎，參與烏龍茶滋味品質的形成。

4 做青過程中脂質過氧化

植物在正常生長條件下，體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡，當處于各種逆境脅迫時這種平衡被破壞，引發(fā)脂質過氧化，導致細胞流動性和通透性發(fā)生改變。

黃福平等[26]等研究結果表明，搖青和自然萎凋均能促進膜脂過氧化產(chǎn)物（丙二醛MDA）積累。陳敏星[13]研究結果表明梅占做青葉在三搖前MDA 含量一直下降，三搖后直到做青結束，MDA 含量持續(xù)上升。溫立香[27]等研究發(fā)現(xiàn)，水分與脂質過氧化極顯著正相關，做青葉片隨著做青進程的增加，其細胞內(nèi)部的MDA 含量和自由基H2O2含量持續(xù)上升。

5 線粒體的變化

線粒體是細胞中產(chǎn)生活性氧的一個重要部位，是細胞凋亡的調(diào)控中心，在細胞凋亡中起關鍵作用[28-30]。植物細胞凋亡主要包括植物自身發(fā)育過程中的細胞凋亡和環(huán)境作用影響的細胞凋亡[31]。逆境條件下，當線粒體膜受到損傷時，膜電位就會降低，線粒體膜上的通透性轉化（MPT）現(xiàn)象是線粒體結構功能發(fā)生改變的重要分子機制[32-33]。

溫立香[27]研究了烏龍茶做青過程中線粒體的理化變化，發(fā)現(xiàn)葉片線粒體膜吸光度從鮮葉至做青結束逐漸下降，說明搖青刺激細胞內(nèi)線粒體膜通透性轉化（MPT）的發(fā)生；烏龍茶做青過程中葉片線粒體中的MDA 和H2O2含量都逐漸增加，說明了做青導致葉片線粒體被活性氧毒害。

目前對于烏龍茶做青過程中細胞內(nèi)是否會發(fā)生凋亡現(xiàn)象及與凋亡密切相關的線粒體的變化方面研究鮮少，但在其他植物上的研究已有報道[34-35]，做青相當于一個逆境脅迫的過程，可參考已有逆境對細胞變化影響的研究，將其運用在做青葉內(nèi)部微觀的細胞學研究上，從而揭示烏龍茶做青的內(nèi)在機理。

6 烏龍茶做青過程基因表達

6.1 GGDPS 基因

牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶（Geranyl geranyl diphosphate synthase，GGDPS），是植物萜類物質合成途徑中的關鍵酶之一。姚雪倩等[36]等克隆出鐵觀音CsGGDPS 基因并利用實時熒光定量技術檢測該基因在做青過程中的表達模式。結果表明，從鮮葉到曬青葉，該基因表達量較低且增長較慢，但隨著搖青的進程表達量顯著增加，且在殺青前表達量達到最高，約為鮮葉的20倍，推測該基因參與烏龍茶萜烯類香氣品質形成。

6.2 CsID 基因

陳丹[37]等克隆與萜類化合物形成相關的異戊烯基焦磷酸異構酶（CsIDI1 和CsIDI2）并利用實時熒光定量PCR 技術檢測此基因在做青過程中的表達變化，發(fā)現(xiàn)做青過程中，CsIDI1 和CsIDI2 基因表達量上升，這與前人的研究結果一致，表明CsIDI1 和CsIDI2 基因在烏龍茶做青過程中受到脅迫促進萜類香氣物質的形成。

6.3 CsMVK 基因

王鵬杰[38]等克隆出與萜類化合物形成相關的酶基因（CsMVK 基因）并實時熒光定量 PCR檢測此基因在做青過程中的表達特性，發(fā)現(xiàn)烏龍茶在做青過程中，CsMVK 基因在曬青到一搖過程表達量下降，但經(jīng)過3 次搖青，表達量在殺青前達到最大值，推測 CsMVK 基因在做青過程中受到機械力的損傷使其表達增加，參與茶葉萜類香氣物質的形成，這也與前人研究的做青期間可促進香精油的積累相符[39-40]。

6.4 CsTPS 基因

單萜合成酶（monoterpene synthases, mono,TPs）是植物單萜化合物合成途徑的限速酶。王鵬杰[41]等克隆了CsTPS 基因并利用實時熒光定量PCR 技術研究該基因在烏龍茶做青過程中的表達模式，結果表明，該基因從鮮葉到曬青階段表達量顯著增加，曬青葉的表達量是鮮葉的3倍，一搖二搖后表達量下降，三搖和殺青前期表達量顯著上升，且殺青前期表達量是鮮葉的3.8倍，推斷該基因參與烏龍茶香氣品質的形成。

6.5 CsNCED 基因

做青過程相當于茶樹葉片處于逆境脅迫的過程，脫落酸在植物逆境脅迫響應中發(fā)揮著重要作用。9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶NCED是植物ABA 生成的關鍵酶，王贊[42]等克隆出與調(diào)控ABA 含量密切相關的鐵觀音CsNCED2基因，并實時熒光定量PCR 檢測此基因在烏龍茶做青過程中的表達模式，發(fā)現(xiàn)從鮮葉到曬青結束，CsNCED2 表達量顯著增加并達到第一個峰值，之后的搖青其表達量下降，到殺青前，CsNCED2 表達量顯著上升，達到最高。說明做青過程此基因表達量顯著增加，激發(fā)了以ABA含量為基礎的氣孔開閉和脅迫氧化應激反應。Cho 等研究發(fā)現(xiàn)NCED 在做青過程中表達存在顯著差異[43]。

7 展望

目前對烏龍茶做青過程中葉片的研究主要集中在葉片的生化成分、葉片內(nèi)的酶、香氣、脂質過氧化等的研究上，但對于做青過程中與品質形成相關的分子研究尚處于初始階段。近幾年，隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，對于烏龍茶品質形成的分子機制研究需要深入到細胞或亞細胞水平上，更精確地去探明烏龍茶品質形成的內(nèi)部調(diào)控機制[44-45]。隨著科學技術手段的提升與發(fā)展，烏龍茶做青將從宏觀的工藝研究轉向微觀的細胞學研究，深入探究烏龍茶做青與品質關系的內(nèi)在機理，為烏龍茶做青的技術經(jīng)驗提供理論支持，也為烏龍茶工藝優(yōu)化、品質提高和高效生產(chǎn)奠定理論基礎[46]。