車妤杰,彭佳昊,王浩嘉,劉詩(shī)雨,杜昊男,舒 剛,呂 程

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都610000）

《傷寒論·厥陰篇》記載的當(dāng)歸四逆湯[1]有活血化瘀之效[2]，花椒有抗炎鎮(zhèn)痛[3]、抗氧化和改善缺血等作用[4]。有研究表明[5]，加味花椒兩者同用可增強(qiáng)溫經(jīng)通脈的療效。

根據(jù)齊笑等人的研究[6]可知噴膜劑一般選擇聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羥丙甲基纖維素（HPMC）、殼聚糖等中的一種或幾種作為主要成膜材料。其中PVP系列的成膜效果最好，可單獨(dú)成膜，且種類多樣，其中成膜效果與其分子量呈正比關(guān)系，當(dāng)K＜30時(shí)耗材大效果不佳，而K90分子量過(guò)大，形成的溶液粘稠難以呈噴射狀，而PVPK－30各方面效果良好，是目前噴膜劑最主要的成膜材料。殼聚糖鹽酸鹽是一種水溶性好且具備殼聚糖[7]所有優(yōu)點(diǎn)的生物成膜材料[8]，可搭配其余材料制成良好的噴膜劑。中藥配方中5種藥材當(dāng)歸、赤芍、甘草、花椒和大棗均含有黃酮類成分[9－13]，則可確定黃酮為試驗(yàn)復(fù)方主要活性成分。

試驗(yàn)旨在研制出一種使用方便，能加強(qiáng)藥物吸收性的噴膜劑，通過(guò)薄層色譜對(duì)樣品進(jìn)行定性鑒別，并根據(jù)2015版《中國(guó)藥典》[14]測(cè)定總黃酮含量，為研究中藥復(fù)方當(dāng)歸四逆湯的新型外用劑型提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 低速離心機(jī)SC－3614（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；U－2800A紫外分光光度儀（上海尤尼柯儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（海門市艾斯特試驗(yàn)器材廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；1XC－110A型超聲波清洗器（濟(jì)寧鑫欣超聲電子設(shè)備有 限公司）；真空泵；RHYB－4磁力攪拌器（常州市人和儀器廠）；電子分析天平（沈陽(yáng)龍騰電子有限公司）；ZF－1三用紫外分析儀紫外光燈（上海馳唐實(shí)業(yè)有限公司）；細(xì)菌培養(yǎng)箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；硅膠GF254薄層板；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）。

1.2 材料 當(dāng)歸、桂枝、赤芍、細(xì)辛、炙甘草、通草、大棗（七種藥材均來(lái)自溫江福壽堂大藥房）；花椒（購(gòu)買自溫江宜家樂(lè)購(gòu)物中心）；殼聚糖鹽酸鹽（山東優(yōu)索化工科技有限公司，脫乙酰度90%）；薄荷腦（安國(guó)藥源商貿(mào)有限公司）；乙醇；PVPK－30；丙三醇；碳酸氫鈉；二甲苯；三氯甲烷；乙酸乙酯；冰醋酸；乙醚；甲醇；正丁醇；亞硝酸鈉；硝酸鋁；NaOH；阿魏酸對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110773－201614）；芍藥苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110736－201842）；蘆丁對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):100080－201610）；5%香草醛硫酸溶液（由乙醇和98%濃硫酸配制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材提取 稱取當(dāng)歸54 g，桂枝27 g，赤芍54 g，細(xì)辛3 g，炙甘草18 g，通草18 g，大棗27 g，花椒 18 g，將全部藥材先以適量水浸潤(rùn)30 min，再加水煎煮2次，依次為處方的8倍量和6倍量水，煎煮時(shí)間依次為1.5 h和1 h，合并上面兩次的水煎液，并在60℃減壓濃縮，冷卻至室溫，用1 moL·L－1的NaHCO3調(diào)pH值使藥液pH值在5～7之間，攪拌均勻，4℃冷藏備用。

2.2 正交試驗(yàn) 通過(guò)正交試驗(yàn)確定試驗(yàn)成膜材料殼聚糖鹽酸鹽（A）、PVPK －30（B）、乙醇（C）的水平用量，進(jìn)行三因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)[8]，安排如表1。通過(guò)對(duì)樣品成膜性、成膜時(shí)間以及溶液澄清度及噴射效果進(jìn)行打分，最好者為100分，依次降低10分，計(jì)算綜合得分以此作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

表1 設(shè)計(jì)三因素三水平表Tab 1 Designs a three-factor three-level table

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Orthogonal test results

表3 正交試驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)Tab 3 Evaluation index of orthogonal test

表4 各水平均值Tab 4 Means of each level

表5 方差及顯著性分析Tab 5 Variance and significance analysis

在第3項(xiàng)溶液澄清度及噴射效果的評(píng)價(jià)時(shí)，因每組樣品均為紅棕色澄清透明液體，無(wú)法比較，則不并入綜合得分中。用SPSS18.0中處理數(shù)據(jù)的結(jié)果表明，因素A、B、C的P值均大于0.05，無(wú)顯著影響，不必再進(jìn)行各因素水平間多重比較。此時(shí)，可從表4中選擇平均值最大的水平成最優(yōu)水平組合，即1%殼聚糖鹽酸鹽、3%PVPK－30和40%無(wú)水乙醇為最佳成膜配比。

2.3 樣品制備及性狀 依次稱取處方量的殼聚糖鹽酸鹽和薄荷腦粉末加入適量蒸餾水中，磁力攪拌至溶解，再加入3%量的甘油繼續(xù)充分?jǐn)噭?，另稱取PVPK－30加入到400 mL乙醇中溶解。將上述溶液混勻之后加入藥液，再混合均勻，最后加蒸餾水定容至1 L，即得樣品溶液（生藥濃度為219 mg/mL），分裝，且樣品為澄清的清涼氣味的紅棕色溶液。

2.4 薄層色譜鑒定 當(dāng)歸中阿魏酸的鑒定:取本品10 mL，置分液漏斗中，加水10 mL，加乙醚30 mL振搖提取，分取乙醚液，水浴蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。另取阿魏酸對(duì)照品，加甲醇制成1 mg·mL－1的溶液，作為對(duì)照品溶液。按制備工藝制成缺當(dāng)歸的陰性制劑樣品，并按供試品溶液制備方法制備，作為缺當(dāng)歸的陰性對(duì)照溶液。吸取供試液10μL，對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照品溶液各2μL分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以正己烷－乙酸乙酯（4∶1）為展開(kāi)劑[14]，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視，結(jié)果表明，樣品與阿魏酸對(duì)照品在同一位置顯示紫色斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照無(wú)此斑點(diǎn)，結(jié)果說(shuō)明樣品當(dāng)歸中含有阿魏酸成分且無(wú)陰性干擾。

圖1 阿魏酸薄層色譜圖Fig 1 TLC of ferulic acid

赤芍中芍藥苷的鑒定:取本品20 mL，加水20 mL，搖勻，加正丁醇40 mL振搖提取，分取正丁醇液，水浴蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。另取芍藥苷對(duì)照品，加乙醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按制備工藝制成缺赤芍的陰性制劑樣品，并按供試品溶液制備方法制備，作為缺赤芍的陰性對(duì)照溶液。吸取上述三種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷 －乙酸乙酯 －甲醇 －甲酸（40∶5∶10∶0.2）為展開(kāi)劑[14]，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，在日光下檢視，結(jié)果表明，樣品與芍藥苷對(duì)照品在同一位置顯示藍(lán)紫色斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照無(wú)此斑點(diǎn)，結(jié)果說(shuō)明樣品赤芍中含有芍藥苷成分，且無(wú)陰性干擾。

圖2 芍藥苷薄層色譜圖Fig 2 TLC of paeoniflorin

2.5 總黃酮的含量測(cè)定

2.5.1 對(duì)照品溶液的制備 精確稱取蘆丁對(duì)照品0.0118 g，在50 mL容量瓶中加入40 mL 30%乙醇溶液，置超聲清潔儀中以20℃超聲30 min使溶解，放冷，加30%乙醇定容至刻度，搖勻，得0.2360 mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液。

2.5.2 最大吸收波長(zhǎng)的確立 在200～600 nm范圍之間內(nèi)進(jìn)行紫外掃描確定最大吸收波長(zhǎng)為356 nm。

2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL上述對(duì)照品溶液，分別放于6只干燥潔凈的25 mL容量瓶中，各加30%乙醇至6.0 mL。精密移取1.0 mL的5%NaNO2溶液于容量瓶中，振搖后靜置6 min，再精密量取1.0 mL 的10%Al（NO3）3溶液加入容量瓶中，震蕩搖勻后靜置6 min，然后精密移取10 mL 4%氫氧化鈉溶液于容量瓶中，最后使用30%乙醇溶液定容，震蕩搖晃均勻后靜置15 min，待測(cè)。使用不添加對(duì)照品的空白試劑作為參比，在356 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)。結(jié)果表明，蘆丁對(duì)照品的線性回歸方程為Y＝0.0232X－0.211，相關(guān)系數(shù)r2＝0.9941，在線性范圍0～47.20μg/mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5.4 總黃酮的含量測(cè)定 用移液管精確量取樣品5 mL加入50 mL容量瓶中，再加入30%的乙醇溶液40 mL，置超聲清潔儀中以20℃超聲30 min使溶解，放冷，加30%乙醇定容至刻度，搖勻，之后用布氏漏斗真空減壓抽濾。準(zhǔn)確量取25 mL續(xù)濾液轉(zhuǎn)移于50 mL容量瓶中，用30%乙醇溶液稀釋至刻度定容，搖勻，即得供試品溶液。然后精密量取供試品溶液5 ml于25 mL容量瓶中，按2.5.3項(xiàng)下方法，從“加30%乙醇至6.0 mL”開(kāi)始進(jìn)行操作，測(cè)定吸光度，依法測(cè)定吸光度。同時(shí)不加供試品溶液同上操作，作為空白，帶入線性回歸方程中，計(jì)算求得10組樣品總黃酮含量。

表6 樣品含量測(cè)定Tab 6 Sample content determination

結(jié)果表明，每瓶總黃酮含量在吸收值（A）在0.452～0.483范圍內(nèi)，且1～10組樣品中每瓶總黃酮量分別為:1.89、1.83、1.93、1.97、1.93、1.88、1.92、1.93、1.99 及 1.86 mg/mL，則確定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為每瓶含總黃酮1.83 mg/mL。

3 討論與結(jié)論

3.1 成膜材料的選擇 通過(guò)Yuan等[15]的研究可知其中聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的成膜效果最好，樊榮丹[8]研究表明其衍生物殼聚糖鹽酸鹽是水溶性很好的材料擁有殼聚糖全部?jī)?yōu)點(diǎn)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)殼聚糖鹽酸鹽和PVPK－30以及無(wú)水乙醇以不同比例所做出的樣品的噴膜性相差很大，并且當(dāng)加入1%的殼聚糖鹽酸鹽和3%的PVP－K30以及40%的無(wú)水乙醇時(shí)噴膜效果最好。

3.2 樣品中阿魏酸、芍藥苷的薄層鑒定 阿魏酸是當(dāng)歸的重要成分，具有抗氧化和抗菌消炎的功能[16]，也用于抑制血小板聚集和血栓預(yù)防[17]等方面。赤芍中的芍藥苷可抗血小板聚集和抗血栓形成[18]，也具有鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、解熱解痙抗炎等功能。參考羅音久等[19]和林翠華等[20]對(duì)阿魏酸及芍藥苷的薄層色譜鑒定方法，得出了試驗(yàn)樣品含有阿魏酸和芍藥苷且無(wú)陰性干擾。

3.3 總黃酮含量的測(cè)定 黃酮類化合物具有作為外用制劑的多方面的優(yōu)點(diǎn)，包括抗菌消炎止痛、促愈合、清熱解毒、改善血液循環(huán)等作用。黃酮為本試驗(yàn)復(fù)方的主要活性成分并將其作為主藥含量測(cè)定的對(duì)象。本試驗(yàn)通過(guò)實(shí)驗(yàn)室的紫外分光光度計(jì)進(jìn)行最大吸收波長(zhǎng)的掃描確定，發(fā)現(xiàn)本機(jī)器上蘆丁對(duì)照品的最大吸收波長(zhǎng)為356 nm。并且檢測(cè)了試驗(yàn)的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性以及加樣回收率[21]均良好，且得出標(biāo)準(zhǔn)為每瓶含總黃酮的含量為1.83 mg/mL。

3.4 結(jié)論 當(dāng)歸四逆湯可活血化瘀，花椒可抗炎鎮(zhèn)痛及改善組織缺血，二者同用可增強(qiáng)溫經(jīng)通脈的療效，還能扶正祛邪及標(biāo)本兼顧。而現(xiàn)今當(dāng)歸四逆湯的方劑制成外用多為膏劑，存在許多缺點(diǎn)，而噴膜劑能在皮膚、黏膜等處表面快速形成一層透氣性良好的可溶性生物薄膜，可以保護(hù)瘡面并且具有抗菌消炎的作用，且使用方便。本試驗(yàn)根據(jù)多名研究者的相關(guān)資料進(jìn)行試驗(yàn)，制備出以1%的殼聚糖鹽酸鹽和3%的PVP－K30作為主要成膜材料，40%的乙醇為溶劑，3%的甘油作為增塑劑和0.1%薄荷腦作為促滲劑、219 mg/mL加味當(dāng)歸四逆湯復(fù)方為處方的加味當(dāng)歸四逆殼聚糖噴膜劑，并且制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)保證每瓶總黃酮含量為1.83 mg/mL，為進(jìn)一步研究成膜效果更佳且有活血化瘀作用的中藥復(fù)方噴膜劑提供參考。