喻運(yùn)珍,余少梅,張立強(qiáng),李 娟,鄧 平,羅楊志,高銀愛(ài),丁運(yùn)敏

（1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，武漢430207；2.武漢中博水產(chǎn)生物技術(shù)有限公司，武漢430207；3.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，武漢430065；4.武漢市武湖農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，武漢430334）

穿梅三黃散是由大黃、黃芩、黃柏、穿心蓮、烏梅五味藥材粉碎加工而成的，具有清熱解毒功能，用于治療魚(yú)類(lèi)細(xì)菌性敗血癥、腸炎、爛鰓與赤皮病[1]。通常產(chǎn)品是經(jīng)普通粉碎，粉末粒度在80～120目（150～180μm）之間。中草藥極細(xì)粉粉末粒度在一般在150目（90μm）在200目（75μm）之間[2]。超微粉一般指細(xì)胞級(jí)微粉，利用機(jī)械或流體動(dòng)力方法，將3 mm以上的中草藥顆粒，加工成30μm以下粒徑的粉散劑，一般粒徑為5～47μm，細(xì)胞破壁率達(dá)95%以上。與傳統(tǒng)粉散劑比較，中草藥超微粉具有有效成分釋放快、生物利用率高、臨床作用效果顯著等特點(diǎn)[3]。研究以穿梅三黃散為研究對(duì)象，比較了1000目超微粉和200目極細(xì)粉之間顯微特征及藥效學(xué)差異，旨在為穿梅三黃散超微粉應(yīng)用提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)參考。

1 材 料

1.1 藥材 大黃、黃芩、黃柏、穿心蓮、烏梅，均購(gòu)自安徽旭松中藥飲片有限公司，經(jīng)公司質(zhì)檢部門(mén)按照《中華人民共和國(guó)獸藥典2015年版二部》鑒定合格。穿梅三黃散由以上5種藥材按比例粉碎混合而成，穿梅三黃散超微粉，委托山東埃爾派粉體科技股份有限公司生產(chǎn)，過(guò)1000目篩；穿梅三黃散極細(xì)粉為本公司自行粉碎生產(chǎn)，過(guò)200目篩。

1.2 菌株 嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、柱狀黃桿菌（Flavobacterium cloumnare）和腸型點(diǎn)狀氣單胞菌（Aromonas punctata f.intestinalis）為實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 草魚(yú)，購(gòu)置于江夏山坡某養(yǎng)殖戶(hù)，50±5 g，置于網(wǎng)箱中暫養(yǎng)一周。

1.4 試驗(yàn)試劑 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和Shieh營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.5 主要儀器 BM1000生物顯微鏡（南京江南永新光學(xué)有限公司）；JFC－1600真空離子濺射鍍膜儀、JSM－6510LV掃描電鏡（日本電子公司）；Chemray 240全自動(dòng)生化分析儀（深圳雷杜生命科技）；2HP－100生化培養(yǎng)箱（上海蘇進(jìn)儀器設(shè)備廠）。

2 方 法

2.1 顯微觀察 生物顯微鏡觀察:取少量粉末，水合氯醛透化，于生物顯微鏡下觀察粉末特點(diǎn)[4]。

電鏡觀察:取適量樣品，用導(dǎo)電銀膠粘在樣品臺(tái)上，經(jīng)鍍膜儀噴金后，于掃描電子顯微鏡下觀察[5]。

2.2 抑菌試驗(yàn)[6－7]

2.2.1 菌液配制 將嗜水氣單胞菌、柱狀黃桿菌和腸型點(diǎn)狀氣單胞菌分別接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，28℃下培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)液配制成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木簜溆?。將柱狀黃桿菌接種于Shieh營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，28℃下培養(yǎng)48 h，取培養(yǎng)液配制成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木簜溆谩?/p>

2.2.2 藥液配制 采用倍比稀釋法。將穿梅三黃散紫外照射滅菌后，用無(wú)菌水配制768 mg/mL母液。取9支滅菌試管，第1管中加入5 mL肉湯培養(yǎng)基，2～8管加入3 mL；取1 mL母液至第1管中，混勻后吸取3 mL至第2管，混勻吸取3 mL至第3管，依次類(lèi)推至第7管，混勻后，吸取3 mL棄去。1 ～7管穿梅三黃散濃度分別為 128，64、32、16、8、4、2 mg/mL。第8管為肉湯對(duì)照，第9管為藥液對(duì)照。

2.2.3 最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定 分別吸取100μL菌液加至1～8管中，28℃培養(yǎng)24 h后觀察，沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)的最小濃度為最小抑菌濃度（MIC）。每種試驗(yàn)藥物設(shè)3組平行，MIC結(jié)果取其平均值。

2.3 飼喂試驗(yàn)

2.3.1 試驗(yàn)分組及處理 試驗(yàn)在2 m×2 m×1.5 m網(wǎng)箱中進(jìn)行，分為三組，對(duì)照組、超微粉組和極細(xì)粉組，每組投放30尾草魚(yú)。對(duì)照組投喂普通市售飼料，用藥組投喂拌藥飼料，飼料添加量為20 g/kg，每日投喂3次，連續(xù)投喂10 d。

2.3.2 樣品采集及指標(biāo)測(cè)定[8]試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每組取草魚(yú)6尾，尾靜脈采血，4℃下靜置1 h后3000 r/min離心10 min，取上清得到血清；取肝臟制成10%組織勻漿。血清用于測(cè)定谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）含量；肝組織勻漿用于測(cè)定過(guò)氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH－PX）含量。 AST、ALT采用自動(dòng)生化測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定，組織中CAT、MDA、SOD、GSH－PX采用南京建成試劑盒測(cè)定。

3 結(jié)果與分析

3.1 顯微觀察 穿梅三黃散極細(xì)粉在生物顯微鏡下可以觀察到五味藥材的各種特有特征（圖1ag），而超微粉幾乎觀察不到任何細(xì)胞形態(tài)（圖1h），其藥物特有的特征均消失。

在掃描電鏡下可以觀察到，穿梅三黃散超微粉（圖2b）粉體粒徑更小，粒徑分布更加均勻。

圖1 穿梅三黃散超微粉和極細(xì)粉普通顯微鏡觀察（×100）Fig 1 Microscopic characteristics of ultrafine and very fine powder of Chuanmei Sanhuang San observed by microscope（ ×100）

圖2 穿梅三黃散超微粉和極細(xì)粉掃描電鏡觀察Fig 2 Microscopic characteristics of ultrafine and very fine powder of Chuanmei Sanhuang San observed by scanning electron microscope

3.2 抑菌試驗(yàn) 由表1可以看出，穿梅三黃散超微粉和極細(xì)粉對(duì)嗜水氣單胞菌的MIC分別為32和64 mg/mL，柱狀黃桿菌為32和64 mg/mL，腸型點(diǎn)狀氣單胞菌為8和32 mg/mL，超微粉對(duì)各致病菌的MIC均小于極細(xì)粉，其中對(duì)嗜水氣單胞菌、柱狀黃桿菌的MIC是極細(xì)粉的1/2，對(duì)腸型點(diǎn)狀氣單胞菌的MIC是極細(xì)粉的1/4。說(shuō)明穿梅三黃散超微粉浸出液對(duì)3種致病菌的抑菌效果優(yōu)于極細(xì)粉。

表1 穿梅三黃散超微粉和極細(xì)粉對(duì)3株細(xì)菌的最小抑菌濃度（MIC）Tab 1 MIC of ultrafine and very fine powder of Chuanmei Sanhuang San on three bacteria

3.3 飼喂試驗(yàn) 由表2及表3可以看出，拌飼投喂穿梅三黃散后，血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、丙二醛（MDA）含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），其中超微粉組小于極細(xì)粉組，具有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），表明飼喂穿梅三黃散能夠降低試驗(yàn)草魚(yú)血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）酶活性及肝組織中丙二醛（MDA）含量。

過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH－PX）含量顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），其中超微粉組顯著高于極細(xì)粉組（P＜0.05），表明飼喂穿梅三黃散能夠提高試驗(yàn)草魚(yú)肝組織中過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH－PX）酶活性。

表2 穿梅三黃散超微粉和極細(xì)粉對(duì)血清中AST和ALT影響Tab 2 Effects of ultrafine and very fine powder of Chuanmei Sanhuang San on AST and ALT in serum

表3 穿梅三黃散超微粉和極細(xì)粉對(duì)肝臟組織中SOD、CAT、GSH-PX和MDA的影響Tab 3 Effects of ultrafine and very fine powder of Chuanmei Sanhuang San on liver tissue SOD，CAT，GSH-Px，MDA

4 討論與結(jié)論

穿梅三黃散超微粉對(duì)3種魚(yú)類(lèi)致病菌的最小抑菌濃度均小于極細(xì)粉，抑菌作用顯著優(yōu)于極細(xì)粉。這是因?yàn)樗幬锪Ｗ拥拇笮『头垠w的結(jié)構(gòu)是影響藥物溶出度的重要因素。穿梅三黃散經(jīng)超微粉碎，粉碎更充分，粉末粒徑更?。▓D2），有效成分更易溶出。一般情況下，中草藥中有效成分需要經(jīng)過(guò)浸潤(rùn)、溶脹、滲透和分散才能溶出，采用超微粉碎工藝消除阻力能夠加快溶出速率、溶出量[9]。蔡萍等研究發(fā)現(xiàn)，超微粉碎技術(shù)可以顯著加快五苓散中桂皮醛的體外溶出率[10]。張國(guó)祖等在研究中發(fā)現(xiàn)，在相同浸泡條件下，扶正解毒散超微粉中，淫羊藿苷的浸出量比普通粉平均提高了115%，水溶性浸出物提高了17%，總糖提高31%[11]。研究中，體外抑菌試驗(yàn)間接反映了穿梅三黃散有效抑制菌成分溶出度高于極細(xì)粉，與以上研究結(jié)果一致。

谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）是肝細(xì)胞受到損傷的敏感指標(biāo)，肝細(xì)胞受損時(shí)，血液中酶活性升高；超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH－PX）是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，肝細(xì)胞受損時(shí)，酶活性降低；而丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，其含量變化間接反映了機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化水平和肝細(xì)胞損傷程度，肝細(xì)胞受到損傷時(shí)，丙二醛（MDA）含量升高[12]。研究中發(fā)現(xiàn)穿梅三黃散能夠降低谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）酶活性，降低丙二醛（MDA）含量，提高超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH－PX）酶活性，說(shuō)明穿梅三黃散能夠改善魚(yú)類(lèi)的肝臟狀況，提高肝臟抗損傷能力，其中超微粉作用效果優(yōu)于極細(xì)粉。

中草藥經(jīng)過(guò)細(xì)胞破壁后有效成分完全釋放出來(lái)，由于超微粉顆粒粒徑小，因此具有表面效應(yīng)、體積效應(yīng)等特性，對(duì)物質(zhì)的吸附性増大，有利于畜禽機(jī)體對(duì)藥物的吸收利用，因而治療效果有質(zhì)的飛躍[13]。顧建明等[14]研究發(fā)現(xiàn)，0.5%中藥超微粉能顯著促進(jìn)肉雞免疫器官發(fā)育，提高機(jī)體免疫功能，且可達(dá)到1%中藥粗粉的效果。李榮譽(yù)等[15]分別觀察了三七、元胡、大黃超微粉對(duì)小白鼠的凝血、鎮(zhèn)痛和腸蠕動(dòng)作用的影響，超微粉作用效果優(yōu)于普通粉，均得出本研究相似結(jié)論。

終上所述，穿梅三黃散超微粉能夠顯著提高抑菌能力及魚(yú)類(lèi)肝臟抗損傷能力。由于大多數(shù)水生動(dòng)物沒(méi)有胃，腸道相對(duì)較短，簡(jiǎn)單粉碎的中草藥在水生動(dòng)物體內(nèi)留存時(shí)間短，利用率低，有的藥材有效成分還沒(méi)有釋放出來(lái)就被排出體外，造成極大的浪費(fèi)。經(jīng)超微粉碎后，藥物粉體活性進(jìn)一步增強(qiáng)，溶出率提高，有效成分能夠較快的進(jìn)入魚(yú)體，發(fā)揮作用，藥效增強(qiáng)。因此，中草藥超微粉在水生動(dòng)物疫病防治上具有很好的應(yīng)用前景。