芮海云, 劉清泉, 沈振國(guó)

(1. 泰州學(xué)院 醫(yī)藥與化學(xué)化工學(xué)院, 泰州 225300； 2. 江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所 觀賞植物研究中心， 南京 210024； 3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 南京 210095)

農(nóng)業(yè)土壤的重金屬污染已成為嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題，不僅直接影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育、農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)，還通過(guò)食物鏈危及人類(lèi)的健康。因此，重金屬對(duì)農(nóng)業(yè)土壤的污染及其在土壤-植物系統(tǒng)中的遷移成為當(dāng)今普遍關(guān)注的全球環(huán)境問(wèn)題，植物重金屬耐性的機(jī)理也逐漸成為研究的熱點(diǎn)之一。植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，形成了一系列對(duì)重金屬毒害的適應(yīng)性機(jī)制，主要包括排斥和積累兩個(gè)機(jī)制。在排斥機(jī)制中，植物限制根系對(duì)重金屬離子的吸收和從根系向地上部的運(yùn)輸，或主動(dòng)向細(xì)胞外運(yùn)輸有毒離子，在這方面根質(zhì)外體、根系分泌物和菌根可能起著重要作用；而在積累機(jī)制中，植物把重金屬分布在特定的器官、組織或細(xì)胞器，以低生物活性的解毒形態(tài)存在。

近年來(lái)的研究表明，質(zhì)外體不僅是一個(gè)結(jié)構(gòu)性的被動(dòng)防御屏障，更是一個(gè)動(dòng)態(tài)性的主動(dòng)防御體系，在植物抵抗重金屬脅迫中具有重要作用。質(zhì)外體由細(xì)胞壁、細(xì)胞間隙、胞間層和導(dǎo)管的空腔組成，其中的液體被稱(chēng)為質(zhì)外體汁液。細(xì)胞壁包括初生壁和次生壁，相鄰細(xì)胞初生壁間有胞間層。初生壁主要由蛋白質(zhì)和多糖(包括纖維素、半纖維素和果膠)組成，次生壁除同樣含纖維素和半纖維素外，大部分為木質(zhì)素。蛋白質(zhì)約占質(zhì)外體所有成分的5%～10%。質(zhì)外體汁液中的蛋白質(zhì)與細(xì)胞壁幾乎沒(méi)有相互作用，在質(zhì)外體空間自由移動(dòng)。細(xì)胞壁中的蛋白質(zhì)，一類(lèi)通過(guò)范德華力、氫鍵、親水或離子鍵與細(xì)胞壁基質(zhì)松散結(jié)合；另一類(lèi)是細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白，通過(guò)共價(jià)鍵與細(xì)胞壁骨架結(jié)合，富含羥脯氨酸、脯氨酸和甘氨酸。由于早期人們對(duì)質(zhì)外體蛋白質(zhì)作用的忽視，加之其提取遠(yuǎn)較胞內(nèi)蛋白質(zhì)困難，因此質(zhì)外體蛋白質(zhì)的研究落后于胞內(nèi)蛋白質(zhì)。近年來(lái)，隨著植物質(zhì)外體蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展, 越來(lái)越多的質(zhì)外體蛋白質(zhì)被鑒定出來(lái), 為研究質(zhì)外體蛋白質(zhì)的功能奠定了良好的基礎(chǔ)。目前約500種擬南芥(Arabidopsisthaliana)質(zhì)外體蛋白質(zhì)已被鑒定；其次為水稻(Oryzasativa)，有314種質(zhì)外體蛋白質(zhì)被鑒定；關(guān)于鷹嘴豆(Cicerarietinum)、大豆(Glycinemax)、向日葵(Helianthusannuus)、煙草(Nicotianatabacum)、苜蓿(Medicagosativa)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)和玉米(Zeamays)等植物的質(zhì)外體蛋白質(zhì)分析也已見(jiàn)報(bào)道[2]。這些質(zhì)外體蛋白質(zhì)的功能主要有：1)參與多糖代謝，如糖苷水解酶和糖酯酶等；2)參與脅迫響應(yīng)，如類(lèi)萌發(fā)素蛋白、索馬甜蛋白和幾丁質(zhì)酶等；3)參與蛋白質(zhì)代謝，如蛋白酶、蛋白酶抑制劑等；4)參與氧化還原反應(yīng)，如過(guò)氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)等；5)參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，如蛋白激酶等[1-2]。

大量研究表明，作為金屬離子跨膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的第一道屏障，植物細(xì)胞壁對(duì)于重金屬離子進(jìn)入細(xì)胞起很好的屏障作用。植物細(xì)胞通過(guò)影響細(xì)胞壁中多糖、蛋白質(zhì)和木質(zhì)素等成分的生物合成，可以改變其結(jié)合重金屬離子的能力，或改變重金屬的運(yùn)輸與分配以及植物的生長(zhǎng)發(fā)育，從而影響植物對(duì)重金屬的耐性[3]。質(zhì)外體蛋白質(zhì)參與植物細(xì)胞壁的重構(gòu)[4]，在植物對(duì)重金屬的耐性中發(fā)揮重要作用。本文主要介紹質(zhì)外體蛋白質(zhì)在植物抗重金屬脅迫方面的研究進(jìn)展。

1 細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白在植物重金屬耐性中的作用

植物細(xì)胞壁中主要的結(jié)構(gòu)蛋白包括富含脯氨酸的蛋白 (PRPs)、富含甘氨酸的蛋白 (GRPs)和富含羥脯氨酸糖蛋白(HRGP)家族。HRGP家族主要包括伸展蛋白、富含脯氨酸/羥脯氨酸糖蛋白、茄科凝集素和阿拉伯半乳糖蛋白(AGPs)。細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白通過(guò)共價(jià)鍵與細(xì)胞壁多糖交聯(lián)，這一交聯(lián)是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，可以影響細(xì)胞壁的強(qiáng)度和抗降解能力，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)生物、非生物脅迫的響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5]，同時(shí)植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白的結(jié)構(gòu)和含量也可以影響其結(jié)合重金屬離子的能力。Pan等[6]研究發(fā)現(xiàn)，鋁能顯著誘導(dǎo)水稻根尖細(xì)胞壁HRGP含量升高，減輕鋁的毒害，且鋁耐性品種較鋁敏感品種顯著。Chandran 等[7]報(bào)道鋁脅迫能誘導(dǎo)蒺藜苜蓿AGP基因的表達(dá)，鋁敏感品種較鋁耐性品種顯著。細(xì)胞壁擴(kuò)展蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞壁的松弛和伸展，Pena等[8]研究發(fā)現(xiàn)銅脅迫下小麥主根細(xì)胞壁擴(kuò)展蛋白基因上調(diào)表達(dá)。在鉛脅迫下，大蒜根細(xì)胞壁富含半胱氨酸蛋白含量增加，和Pb2+相互作用，將Pb2+固定在根細(xì)胞壁中[9]。

2 質(zhì)外體多糖代謝蛋白在植物重金屬耐性中的作用

參與多糖代謝的蛋白質(zhì)是主要的質(zhì)外體蛋白質(zhì)，其中糖苷水解酶(GHs)和糖酯酶(CEs)在生物和非生物脅迫下變化顯著，說(shuō)明細(xì)胞壁發(fā)生的改變主要是多糖的斷裂和修飾[5]。

質(zhì)外體多糖代謝包括多糖的轉(zhuǎn)糖苷基、交聯(lián)、水解、轉(zhuǎn)乙?；?、氧化和乙?；萚1]。木葡聚糖是雙子葉植物初生細(xì)胞壁中最主要的半纖維素，木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶(XTH)屬于GH家族，是一類(lèi)催化木葡聚糖分子轉(zhuǎn)移或水解的酶，它能夠內(nèi)切木葡聚糖聚合體，將產(chǎn)生的還原性末端連接到另外一個(gè)木葡聚糖鏈或水分子上，使連接纖維素微纖絲間的木葡聚糖鏈解聚，細(xì)胞壁膨脹疏松，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。Zhu等[10]研究發(fā)現(xiàn), 擬南芥XTH基因T-DNA插入突變體XTH31，根系細(xì)胞壁中木葡聚糖含量減少，降低了對(duì)鋁的結(jié)合力，因此對(duì)鋁的耐性高于野生型。 Yang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，鋁處理能顯著抑制擬南芥根尖細(xì)胞木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶的活性，使木葡聚糖鏈解聚困難，細(xì)胞壁無(wú)法松弛，細(xì)胞伸長(zhǎng)受到抑制。

作用于果膠的CEs也是在生物和非生物脅迫下變化顯著的質(zhì)外體蛋白質(zhì)。果膠主要由半乳糖醛酸聚糖、鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅰ(RG-Ⅰ)和鼠李半乳糖醛酸聚糖Ⅱ(RG-Ⅱ)構(gòu)成，半乳糖醛酸聚糖是半乳糖醛酸通過(guò)Ca2+交聯(lián)的聚合體，RG-Ⅰ和RG-Ⅱ由半乳糖醛酸和鼠李糖構(gòu)成的主鏈和各自特有的支鏈糖基構(gòu)成。果膠甲酯酶(PME)負(fù)責(zé)細(xì)胞壁中果膠的脫甲基化，使果膠帶有更多的自由羧基，提高了其結(jié)合重金屬的能力。Paynel等[12]研究發(fā)現(xiàn)，鎘處理能誘導(dǎo)亞麻PME活性增加。東南景天鎘超積累生態(tài)型根中PME的活性低于非超積累生態(tài)型，根中有更多的甲基酯化的果膠, 因此根部較非超積累生態(tài)型駐留較少的鎘，更多的鎘轉(zhuǎn)運(yùn)至地上部[13]。 此外，Chen等[14]報(bào)道，過(guò)表達(dá)MAN3基因?qū)е聰M南芥甘露聚糖酶活性升高，細(xì)胞壁中甘露糖含量增加，因此擬南芥的鎘積累和鎘耐性增加。

3 質(zhì)外體氧化還原蛋白在植物重金屬耐性中的作用

質(zhì)外體氧化還原蛋白調(diào)節(jié)質(zhì)外體氧化還原狀態(tài)，影響細(xì)胞壁木質(zhì)素和多糖的組成，影響植物對(duì)重金屬的耐性[15]。

許多研究結(jié)果顯示，重金屬誘導(dǎo)活性氧(ROS)在植物根系和葉片質(zhì)外體中的積累，誘導(dǎo)酶和非酶抗氧化系統(tǒng)的響應(yīng)。我們的研究結(jié)果顯示[16]，鎘誘導(dǎo)H2O2在植物根質(zhì)外體中的積累，質(zhì)外體H2O2的增加伴隨著質(zhì)外體煙酰胺腺嘌呤二核苷酸-過(guò)氧化物酶(NADH-POD)活性的升高，推測(cè)NADH-POD是質(zhì)外體H2O2的來(lái)源之一。Zhang等[17]報(bào)道鎘脅迫下箭舌豌豆葉質(zhì)外體汁液中含有較高的抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)活性，根質(zhì)外體汁液中含有較高的SOD活性。過(guò)表達(dá)SOD和APX的轉(zhuǎn)基因擬南芥中，H2O2的積累激活許多木質(zhì)素合成基因和轉(zhuǎn)錄因子的上調(diào)表達(dá)[18]。

木質(zhì)素合成反應(yīng)是植物應(yīng)對(duì)脅迫的典型防御反應(yīng)。鎘脅迫導(dǎo)致各種植物木質(zhì)素含量的增加，過(guò)量的銅也能導(dǎo)致植物組織中木質(zhì)素的積累，Cheng 等[19]報(bào)道，銅能通過(guò)促進(jìn)Bruguieragymnorrhiza和Rhizophorastylosa的木質(zhì)化，抑制其生長(zhǎng)，降低根的滲透性。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，銅刺激水稻根系的木質(zhì)化，抑制根的伸長(zhǎng)[20]。有假說(shuō)認(rèn)為，木質(zhì)素在根系內(nèi)皮層細(xì)胞壁中的沉積可以抑制金屬元素進(jìn)入木質(zhì)部或從維管束向外的運(yùn)輸，根系木質(zhì)部的木質(zhì)化可以抑制重金屬向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)。木質(zhì)素主要由酚類(lèi)化合物p-香豆醇、松柏醇和芥子醇聚合而成，木質(zhì)素單體在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成后被運(yùn)送至質(zhì)外體，最后在依賴(lài)H2O2的POD和依賴(lài)O2的漆酶(LAC)的催化下，聚合成為高分子木質(zhì)素。

參與木質(zhì)素氧化聚合的主要是第III類(lèi)POD，存在于質(zhì)外體，包括可溶態(tài)POD(SPOD)和細(xì)胞壁離子結(jié)合態(tài)(IPOD)。已有實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，POD基因表達(dá)的下調(diào)會(huì)導(dǎo)致植物木質(zhì)素含量的降低及組成的改變，POD基因swpa4的過(guò)表達(dá)增加植物酚和木質(zhì)素的含量[21]。蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，豇豆在高濃度錳脅迫下, 葉片質(zhì)外體可溶性蛋白的濃度升高，其中一些酸性POD豐度顯著增加[22]。POD還氧化阿魏酸多糖和結(jié)構(gòu)蛋白，導(dǎo)致高度復(fù)雜的大分子的形成，因而增加細(xì)胞和植物的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度[23]。在銅處理的Lygodiumjaponicum(Thunb.) Sw.中，富含糖醛酸的果膠聚合物和其他的細(xì)胞壁組分高度結(jié)合，這一過(guò)程也是在POD的催化下完成的[24]。

植物L(fēng)AC被認(rèn)為和POD一起參與木質(zhì)素單體聚合的過(guò)程。有研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)陸地棉漆酶基因LAC1的楊樹(shù)莖的木質(zhì)素含量高于野生型[25]。Berthet 等[26]對(duì)擬南芥lac4和lac17雙基因敲除突變體的研究發(fā)現(xiàn)，雙突變體莖中木質(zhì)素含量比野生型低40%，并且在持續(xù)光照條件下，雙突變體植株出現(xiàn)矮化現(xiàn)象。擬南芥漆酶LAC11也被證明參與木質(zhì)素單體的聚合過(guò)程，研究發(fā)現(xiàn)LAC4、LAC11 和LAC17 3基因敲除突變體中木質(zhì)素積累幾乎完全得到抑制，植株生長(zhǎng)嚴(yán)重受阻[27]。在擬南芥漆酶基因lac17 突變體中表達(dá)甘蔗漆酶基因SofLAC，能夠恢復(fù)突變體植株木質(zhì)素含量，使其達(dá)到野生型水平，表明SofLAC參與甘蔗的木質(zhì)化過(guò)程[28]。歐洲大葉楊Ptr-miR397a 能夠通過(guò)調(diào)控漆酶基因的表達(dá)改變木質(zhì)素的含量[29]。Bhuiyan 等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在鎘處理下大豆根生長(zhǎng)受到抑制，根木質(zhì)素含量增加，并伴隨著POD和LAC活性的增加。我們通過(guò)漆酶基因(OsLAC10)過(guò)表達(dá)擬南芥株系的研究發(fā)現(xiàn)，漆酶促進(jìn)木質(zhì)素的合成，減少根系對(duì)銅的吸收，增強(qiáng)植株對(duì)銅的耐性[20,31]。

4 質(zhì)外體脅迫響應(yīng)蛋白在植物重金屬耐性中的作用

脅迫響應(yīng)蛋白通過(guò)誘導(dǎo)植物的一般脅迫響應(yīng)過(guò)程，影響植物對(duì)重金屬脅迫的耐性。植物脅迫響應(yīng)蛋白中最豐富的是病程相關(guān)蛋白(PR)，包括幾丁質(zhì)酶、1,3-葡糖苷酶、索馬甜蛋白和類(lèi)萌發(fā)素蛋白等。幾丁質(zhì)酶和1,3-葡糖苷酶都是糖苷水解酶，索馬甜蛋白能破壞細(xì)胞膜或水解細(xì)胞壁多糖的1,3-糖苷鍵。蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯示，75 μmol/L鋁處理3天，水稻葉中幾丁質(zhì)酶豐度上調(diào)2.9倍[32]。豇豆在高濃度錳脅迫下, 葉質(zhì)外體汁液中葡糖苷酶、幾丁質(zhì)酶和類(lèi)索馬甜蛋白的豐度增加[22]。鎘脅迫下，玉米(ZeamaysL.cv. Quintal)和大豆(GlycinemaxL. cv. Korada)細(xì)胞壁β-1,3-葡聚糖酶同工酶活性增加[33]。類(lèi)萌發(fā)素蛋白(GLPs)是植物質(zhì)外體中普遍存在的與小麥萌發(fā)素序列高度相似的可溶性糖蛋白，在植物不同生長(zhǎng)生育階段及不同的生物與非生物脅迫條件下表現(xiàn)出不同的生物學(xué)功能，是一類(lèi)極其重要的脅迫響應(yīng)蛋白。已有研究結(jié)果顯示，GLPs主要以酶、受體和結(jié)構(gòu)蛋白的形式參與多種生理生化過(guò)程，酶包括超氧物歧化酶(SOD)、草酸氧化酶(OXO)、多酚氧化酶(PPOs)和ADP葡萄糖焦磷酸酶、磷酸二酯酶[34]。草酸氧化酶催化草酸降解成H2O2和CO2，最近Sakamoto等[35]利用體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了杜鵑花RmGLP2具有草酸氧化酶(OXO)活性，轉(zhuǎn)RmGLP2煙草細(xì)胞草酸含量降低。SOD和OXO的共同作用是產(chǎn)生H2O2，因此GLPs在質(zhì)外體的存在，可能參與質(zhì)外體 H2O2的形成，進(jìn)而通過(guò)細(xì)胞壁蛋白質(zhì)和多糖的交聯(lián)起到強(qiáng)化細(xì)胞壁的作用。Rietz 等[36]報(bào)道BnGLP3和BnGLP12誘導(dǎo)參與的氧化迸發(fā)在油菜抗真菌病害中起了重要作用。向日葵HaGLP1在擬南芥中的表達(dá)促進(jìn)ROS積累和提高植株抗真菌病的能力[37]。Banerjee 等[38]報(bào)道過(guò)表達(dá)OsGLP1的煙草超量積累H2O2，并引起細(xì)胞壁組分的交聯(lián)，加固細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。Davidson等[39]報(bào)道水稻的12個(gè)GLPs均定位在細(xì)胞壁中，病原菌浸染時(shí)，細(xì)胞壁迅速發(fā)生交聯(lián)作用以保護(hù)水稻葉片免受傷害。蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示GLP(草酸氧化酶活性)在鋁處理的番茄根中被抑制[40]，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)重金屬脅迫下水稻根GLP基因差異表達(dá)[41]，顯示GLP在植物重金屬耐性中發(fā)揮作用。

5 小結(jié)與展望

近年來(lái)的研究表明，質(zhì)外體蛋白質(zhì)在植物重金屬耐性中具有重要作用，然而質(zhì)外體蛋白質(zhì)如何影響質(zhì)外體氧化還原穩(wěn)態(tài)，參與質(zhì)外體成分的組織和重建，從而影響植物對(duì)重金屬的耐性？其機(jī)理尚不清楚[42]。目前關(guān)于質(zhì)外體蛋白質(zhì)在植物重金屬耐性中作用的研究大多集中在生理生化水平，且是對(duì)少數(shù)質(zhì)外體蛋白質(zhì)的研究。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等技術(shù)的應(yīng)用，可望在整體水平上對(duì)質(zhì)外體蛋白質(zhì)在植物重金屬耐性中作用的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究?？蓢@重金屬脅迫下植物質(zhì)外體蛋白質(zhì)的差異表達(dá)和修飾；質(zhì)外體蛋白質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控；質(zhì)外體蛋白質(zhì)表達(dá)變化與質(zhì)外體氧化還原穩(wěn)態(tài)、質(zhì)外體組成改變的關(guān)系等進(jìn)行研究，以闡明質(zhì)外體蛋白質(zhì)在植物重金屬耐性中的作用及其分子機(jī)制。這不僅具有重要的理論意義，而且還可以通過(guò)分子遺傳學(xué)技術(shù)調(diào)控質(zhì)外體組分的生物合成，改變重金屬在植物體內(nèi)的積累和分配，特別是為降低重金屬在植物可食部分中的積累，保證農(nóng)產(chǎn)品安全，提供新的技術(shù)途徑。