陳耀宇, 王曙光, 孫黛珍

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 太谷 030801)

植物衰老是一個(gè)內(nèi)在的細(xì)胞編程性死亡過程，最明顯的標(biāo)志是植物器官由綠變黃，原因是葉綠素降解和光合能力的下降[1]。然而，過早地衰老會(huì)導(dǎo)致作物品質(zhì)下降、糧食減產(chǎn)。延緩葉片衰老可在灌漿期維持同化碳向籽粒的供應(yīng)，從而保證最大糧食產(chǎn)量。

Thomas和Howarth[2]認(rèn)為持綠是一種植物在花后發(fā)育過程中葉片衰老延遲的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象可能是由于葉片衰老起始晚或者衰老速率慢引起的。因此，Thomas和Smart[3]依據(jù)植物葉片衰老起始的早晚與衰老速率的快慢將持綠突變體分成了5類。A型持綠突變體衰老開始晚，但葉綠素降解速率與野生型相同，延長了光合作用時(shí)間。B型持綠突變體衰老開始時(shí)間與野生型相同，但葉綠素降解速率較慢，延遲了葉片衰老。C型持綠突變體起始衰老時(shí)間和完全衰老時(shí)間均與野生型相同但由于葉綠素降解紊亂，葉綠素含量幾乎保持不變。D型持綠突變體由于突然冷凍或干燥導(dǎo)致葉片死亡，但葉綠素得以保留。E型持綠突變體在成熟期的葉綠素含量高于野生型，在植株衰亡后其葉綠素還未完全降解。A型、B型持綠突變體屬于功能型持綠突變體，在葉綠素得以保留的同時(shí)，光合作用的時(shí)間延長也增加，因此產(chǎn)量提高。C型、D型、E型持綠突變體屬于非功能型持綠突變體，雖然在葉片衰老過程中葉綠素降解緩慢或推遲，但缺乏光合作用的能力[4]。

近年來，利用先進(jìn)的生物技術(shù)手段，已鑒別了一大批持綠突變體，如：STAYGREEN(SGR)[5]、chlorophyll b reductase(CBR)[6]、NON-YELLOW COLORING1 (NYC1)、NYC1-LIKE (NOL)[7]、pheophorbide a oxygenase(PAO)[8]、pheophytin pheophorbide hydrolase (PPH)[9]等，這些突變體都是由于葉綠素降解相關(guān)基因的缺失或突變而形成的(表1)，其中SGR1/NYE1突變體的發(fā)現(xiàn)對(duì)于研究植物葉綠素降解機(jī)制具有重要的作用[10]。本文敘述了SGR的功能、SGR與葉綠素代謝、SGR調(diào)控的最新研究進(jìn)展，為解析作物葉綠素降解機(jī)制提供參考。

表1 葉綠素代謝相關(guān)基因及持綠突變體

1 SGR的功能

孟德爾的綠粒豌豆被廣泛應(yīng)用于遺傳原理的研究，而控制綠粒豌豆非黃化性狀的單隱性基因多年來也一直被科學(xué)家所關(guān)注。Armstead和他的同事們將控制孟德爾綠粒豌豆性狀的基因命名為SGR1或NYE1[11]。Wang等[12]以大白菜nye突變體為材料，精細(xì)定位了BrNYE基因，Jiang等[5]利用水稻sgr突變體，克隆了OsSGR基因。Sato等[13]通過對(duì)豌豆和水稻的sgr突變體的研究發(fā)現(xiàn)衰老后期突變體的葉綠素含量較高，因此他們認(rèn)為SGR能夠促進(jìn)葉綠素的降解。

系統(tǒng)發(fā)生分析表明高等植物的SGR蛋白質(zhì)可以被劃分為兩類[14]：一類為SGR亞族，包含能引起持綠突變的保守結(jié)構(gòu)域；一類為SGRL亞族，SGRL蛋白的C端序列與SGR蛋白的C端序列有很大不同，但在不同的植物中也具有高度保守的結(jié)構(gòu)。所有的高等植物至少含有一種SGRL蛋白，可能含有兩種或多種SGR蛋白[15]，并都被定位到葉綠體上[14]，這也表明SGR可能在質(zhì)體中起作用，與葉綠素代謝相關(guān)聯(lián)。研究發(fā)現(xiàn)，隨著草莓果實(shí)的成熟，SGR蛋白活性逐漸升高，在完熟時(shí)達(dá)到最高，此時(shí)葉綠素迅速降解。擬南芥基因組中包含3種SGR同系物SGR1/NYE1(At4g22920)、SGR2(At4g11910)和SGRL(At1g44000)。在擬南芥葉片衰老過程中，SGR1以葉綠素a為底物去除鎂離子，而SGRL以脫植基葉綠素a為底物脫去鎂離子，SGR1和SGRL均是促進(jìn)葉綠素降解的正向調(diào)節(jié)因子且SGR1發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。對(duì)于擬南芥SGR2的研究目前仍有爭(zhēng)議，Sakuraba等[16]研究發(fā)現(xiàn)，不同于SGR1，SGR2的過表達(dá)植株為持綠植株，而sgr2-1突變體在鹽脅迫、高溫脅迫、干旱脅迫等非生物脅迫與黑暗誘導(dǎo)處理下表現(xiàn)出早期葉片黃化，這表明SGR2是調(diào)節(jié)葉片衰老的負(fù)向調(diào)節(jié)因子。Wu等[17]發(fā)現(xiàn)在sgr1-1與WT擬南芥植株中過表達(dá)SGR2均促使葉片衰老加快，在衰老過程中sgr2-1突變體相對(duì)于WT有更多葉綠素得以保留，這表明SGR2是獨(dú)立于SGR1之外的與葉綠素降解相關(guān)的正向調(diào)節(jié)因子，同時(shí)，啟動(dòng)子交換實(shí)驗(yàn)表明在葉片衰老過程中SGR2的表達(dá)量低于SGR1，這說明SGR1在葉片衰老過程中起主要作用。過表達(dá)SGR1、SGRL的水稻植株在黑暗誘導(dǎo)衰老過程中表現(xiàn)出早期的葉片變黃現(xiàn)象，表明水稻中SGRL的功能與SGR1相類似，均能促進(jìn)葉綠素降解[18]。與擬南芥類似，大豆也包含SGR1/D1、SGR2/D2和SGRL 3種SGR蛋白，而且大豆的d1突變體、d2突變體、d1d2雙突變體均能產(chǎn)生持綠表型，這表明在葉片衰老過程中D1、D2均能促進(jìn)葉綠素降解[19]。任鈞等[20]認(rèn)為大豆中受SGR1和SGR2調(diào)控的持綠性狀可能是源自于同一個(gè)早期變異事件。不同于陸地植物，萊茵衣藻等微細(xì)胞藻類的SGR同系物的C端得以延伸，有一個(gè)長的親水基，不能歸于SGR亞族與SGRL亞族。萊茵衣藻的SGR蛋白，能在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)促使葉綠素降解，而擬南芥的SGR蛋白不能在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)[21]。

除與葉綠素降解相關(guān)外，SGR還具有其他功能。在擬南芥中過表達(dá)SGR后，葉綠素a與葉綠素b含量都會(huì)下降，而SGR并不能降解葉綠素b，這表明SGR能夠誘導(dǎo)葉綠素b還原為葉綠素a。葉綠素b還原酶可由兩種基因編碼，分別為NYC1與NOL，在擬南芥nyc1突變體與nyc1nol雙突變體中過表達(dá)SGR會(huì)使葉綠素b降解受阻，而在擬南芥nol突變體與野生型中過表達(dá)SGR后葉綠素b均能降解，這表明在擬南芥中過表達(dá)SGR會(huì)促進(jìn)NYC1的表達(dá)[22]。種子成熟過程中種皮會(huì)褪綠，因?yàn)槿~綠素的殘留不利于種子貯藏，在香蕉和大蕉果的后熟黃化過程中SGR蛋白的活性會(huì)逐漸升高[15]，擬南芥的sgr1 sgr2雙突變體與abi3突變體都會(huì)產(chǎn)生綠色的種子[16]，在abi3突變體過表達(dá)SGR1、SGR2又會(huì)使種皮變黃，這表明SGR在種皮褪綠中起關(guān)鍵作用。

Fang等[19]通過酵母雙雜交與雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，SGR1能直接或間接地與NYC1、NOL、HCAR、PPH、PAO及RCCR這6種葉綠素降解相關(guān)酶(CCE)在LHCII中發(fā)生生理互作，而且不同SGR蛋白之間還會(huì)形成同源或異源二聚體。為研究SGR2的互作能力是否與SGR1相同，他們又同時(shí)對(duì)SGR1、SGR2進(jìn)行了酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)并通過pull-down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表明SGR2與這6種CCEs相互作用的能力受到了很大的限制。在正常衰老葉片的葉綠素降解過程中SGR1與NYC所形成的復(fù)合體起主要作用，而在脅迫誘導(dǎo)導(dǎo)致的葉綠素降解衰老過程中SGRL與NOL所形成的復(fù)合體起主要作用[16]。這些由SGR、CCEs和LHCⅡ在衰老過程中形成的多蛋白復(fù)合物可能是非衰老綠色組織中去除有毒中間產(chǎn)物所必需的[16]。

2SGR與葉綠素代謝

葉綠素及其衍生物在光合作用中起著至關(guān)重要的作用，光合作用中的大多數(shù)葉綠素分子都能捕獲光能并將其轉(zhuǎn)移到光合作用中心。大多數(shù)綠色植物有兩種不同的葉綠素，葉綠素a和b的生物合成途徑已經(jīng)得到了廣泛的研究[23]，5-氨基乙酰丙酸在經(jīng)過諸多反應(yīng)后合成葉綠素a，在葉綠素合成的最后一步中，一部分葉綠素a在chlorophyllide a oxygenase(CaO)作用下會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥甲基葉綠素a與葉綠素b[14]，但降解途徑目前尚有爭(zhēng)議。葉綠素的降解從葉綠素a開始，葉綠素b含7-羥甲基不能直接被降解，只有轉(zhuǎn)化為葉綠素a才會(huì)被降解[20]。而關(guān)于葉綠素a的降解目前認(rèn)為有兩種途徑：第一種途徑為葉綠素a在降解過程中先脫去鎂離子再脫植醇產(chǎn)生脫鎂葉綠酸a[24]；第二種途徑為葉綠素a在降解過程中先脫去植醇再脫鎂產(chǎn)生脫鎂葉綠酸a[25]。

脫鎂是葉綠素a降解的關(guān)鍵一步，是在脫鎂螯合物酶的作用下失去中心鎂離子形成脫鎂葉綠素a并釋放電子[26]，同時(shí)脫鎂對(duì)photosystem II(PSII)的形成也至關(guān)重要，因?yàn)镻SII的合成始于D1/D2復(fù)合體的形成，而脫鎂葉綠素a正是這一復(fù)合體不可或缺的組成部分[27]。Park等[14]發(fā)現(xiàn)擬南芥中SGR基因編碼了脫鎂螯合物酶，他們將SGR-FLAG重組蛋白導(dǎo)入小麥原生質(zhì)體中，通過高效液相色譜法檢測(cè)葉綠素及其衍生物的含量變化，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，導(dǎo)入SGR1、SGR2重組蛋白的實(shí)驗(yàn)組葉綠素a含量下降，脫鎂葉綠素a含量上升，導(dǎo)入SGRL重組蛋白的實(shí)驗(yàn)組脫植基葉綠素a含量下降，脫鎂葉綠酸a含量上升。這表明在擬南芥中，SGR1與SGR2是第一種途徑中的脫鎂螯合物酶，能脫去葉綠素a的鎂離子形成脫鎂葉綠素a；SGRL是第二種途徑中的脫鎂螯合物酶，能脫去脫植基葉綠素a的鎂離子產(chǎn)生脫鎂葉綠酸a(圖2)。此外，Matsuda等[21]發(fā)現(xiàn)在能夠表達(dá)衣藻SGR蛋白的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中加入葉綠素a后，脫鎂葉綠素a含量增加，當(dāng)加入葉綠素b或其他葉綠素同系物時(shí)，葉綠素及其同系物無明顯變化或變化較小，這表明衣藻SGR能夠特異性的降解葉綠素a。

葉綠素降解過程中產(chǎn)生的脫鎂葉綠酸a會(huì)繼續(xù)在PAO[8]的作用下氧化產(chǎn)生紅色葉綠素分解代謝物，隨后再通過RCCR(red chlorophyll catabolite reductase)轉(zhuǎn)變?yōu)闊晒馊~綠素分解代謝物。

3 SGR的調(diào)控

SGR1與SGR2的結(jié)構(gòu)相似，SGRL與二者相比稍有差異，因此這3種基因的表達(dá)可能會(huì)有所不同。擬南芥在正常生長的長日照條件下，SGR1、SGR2的表達(dá)水平在4周內(nèi)迅速上調(diào)，而SGRL的表達(dá)在前3周呈上升趨勢(shì)，之后下降；在黑暗處理下，SGR1、SGR2的表達(dá)上調(diào)在第3天達(dá)到峰值，而SGRL在黑暗中的表達(dá)迅速下調(diào)[16]。

Chlide a:脫植基葉綠素a； Chlide b:脫植基葉綠素b; Chl a:葉綠素a; Chl b:葉綠素b; Phein a:脫鎂葉綠素a; Pheide a:脫鎂葉綠酸a; RCC:紅色葉綠素分解代謝物; pFCC:熒光葉綠素分解代謝物; CaO:葉綠素a氧化酶; CS:葉綠素合成酶; CBR:葉綠素b還原酶; HCAR:7-羥甲基葉綠素a還原酶; CLH:葉綠素酶; SGR:脫鎂螯合物酶; PPH:脫鎂葉綠素酶; PAO:脫鎂葉綠酸a加氧酶; RCCR:紅色葉綠素降解產(chǎn)物還原酶

圖1 葉綠素代謝途徑
Figure 1 Chlorophyll metabolic pathway

SGR的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，如WRKY與NAC。WRKY 53是一種由H2O2誘導(dǎo)的氧化還原敏感基因，它通過反饋編碼一種自身調(diào)節(jié)其自身合成的轉(zhuǎn)錄因子[28]。WRKY 53能與衰老相關(guān)基因相互作用，下調(diào)WRKY 53的表達(dá)水平會(huì)延緩衰老。生物信息學(xué)分析表明這種轉(zhuǎn)錄因子是衰老調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一種早期作用成分，可能會(huì)調(diào)節(jié)SGR基因的表達(dá)。對(duì)NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究發(fā)現(xiàn)，小麥6號(hào)染色體上的NAC轉(zhuǎn)錄因子基因GPC正向調(diào)節(jié)衰老起始[29]。下調(diào)GPC的轉(zhuǎn)錄水平，會(huì)使小麥葉片衰老延遲24 d，這表明NAC可能會(huì)調(diào)節(jié)SGR的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中有3種NAC轉(zhuǎn)錄因子ANAC046、ANAC087和ANAC100可以直接結(jié)合到NYC1、SGR1、SGR2與PAO的啟動(dòng)子區(qū)域，從而調(diào)控這些葉綠素降解相關(guān)酶基因的表達(dá)，其中ANAC046是葉片衰老的正調(diào)節(jié)因子[30]。

ABI3、ABI5、EEL都是ABA信號(hào)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，ABI3能與SGR1、SGR2啟動(dòng)子區(qū)域的B3結(jié)構(gòu)域(CATGCA)結(jié)合[31]，在黑暗誘導(dǎo)衰老條件下，光敏色素相互作用因子PIF4與PIF5能明顯激活SGR1的表達(dá)。在依賴PIF4/PIF5調(diào)控衰老的葉片中，ABI5與EEL能直接結(jié)合到SGR1啟動(dòng)子區(qū)域的ABA響應(yīng)元件結(jié)構(gòu)域(YACGT)上。除此之外，ABA響應(yīng)元件結(jié)合因子ABF2/3/4也能調(diào)控SGR1的表達(dá)。這表明ABA信號(hào)在SGR1表達(dá)的激活和葉綠素降解中起著重要的作用。有意思的是，在黑暗誘導(dǎo)衰老下，NYC1也能直接被ABI5、EEL轉(zhuǎn)錄因子激活，在種子成熟褪綠過程中ABF4也起到調(diào)控作用。在水稻中ABA信號(hào)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子OsNAP直接激活SGR1與NYC1的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)SGR1與NYC1的表達(dá)，并對(duì)葉片衰老與種子褪綠起重要作用[11]。

植物葉片衰老受到激素的調(diào)節(jié)[32]，細(xì)胞分裂素能夠抑制衰老，擬南芥ore12-1是一種功能型持綠突變體，它的細(xì)胞分裂素受體基因AHK3不需要其他因子的誘導(dǎo)能夠穩(wěn)定表達(dá)，而有的擬南芥持綠突變株系在衰老過程中對(duì)乙烯的反應(yīng)延遲[29]。Jiang等[5]通過激素離體處理水稻幼苗葉片發(fā)現(xiàn)，脫落酸會(huì)促進(jìn)SGR的表達(dá)，而細(xì)胞分裂素則會(huì)抑制SGR的表達(dá)，這表明SGR的表達(dá)還受外源激素的調(diào)節(jié)。

4 展望

20世紀(jì)初，育種家在品種選育時(shí)兼顧了高產(chǎn)性與持綠性,到了20世紀(jì)70年代末，持綠性已經(jīng)被明確確定為玉米等商品糧的優(yōu)良特性，持綠品種具有巨大的市場(chǎng)潛力[4]。SGR基因在植物葉綠素降解和持綠品種的挖掘中起重要作用，雖然近年來SGR基因的功能與表達(dá)模式已被廣泛研究，但僅限于擬南芥、水稻等模式作物中，我國主要糧食作物小麥、玉米等的SGR基因結(jié)構(gòu)與功能尚不清楚，還需要進(jìn)一步研究。今后應(yīng)主要圍繞4個(gè)方面展開研究：1)利用祖先物種區(qū)分小麥等異源多倍體作物每個(gè)染色體組的SGR序列，以此來確定進(jìn)化規(guī)律；2)對(duì)SGR基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析，研究SGR基因的表達(dá)部位、表達(dá)量與葉片衰老時(shí)期的關(guān)系；3)構(gòu)建RNAi、CRISPR-Cas9及過表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證，與此同時(shí)利用高效液相色譜法檢測(cè)葉綠素及其代謝產(chǎn)物的含量；4)利用酵母雙雜交、雙分子熒光互補(bǔ)、免疫共沉淀等方法來確定SGR蛋白與葉綠素降解相關(guān)蛋白的相互作用。

隨著研究的深入，作物衰老的分子機(jī)制必將會(huì)更加明晰，利用分子育種手段選育持綠型作物品種將具有廣闊的前景。