魚體健康狀況評價研究進展

王 淼 衣萌萌 盧邁新

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室, 廣州 510380)

中國擁有世界第一的水產(chǎn)品產(chǎn)量, 也是僅有的養(yǎng)殖產(chǎn)量超過捕撈產(chǎn)量的國家。2016年, 我國的水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)5.142×1010kg, 占全球水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量的60%以上[1]。由于養(yǎng)殖成本的不斷提高, 為了增加效益, 水產(chǎn)養(yǎng)殖向集約化方向發(fā)展。在傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式下, 隨著養(yǎng)殖密度日益增加, 養(yǎng)殖區(qū)域或水體的生態(tài)環(huán)境嚴(yán)重惡化, 水產(chǎn)動物在養(yǎng)殖環(huán)境中可能已經(jīng)處于亞健康狀態(tài), 進而出現(xiàn)了產(chǎn)品質(zhì)量下降、病害蔓延等問題, 嚴(yán)重影響水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。以低能耗、高產(chǎn)出、生態(tài)環(huán)保、綜合效益穩(wěn)定等為特點的水產(chǎn)健康養(yǎng)殖模式, 逐漸成為研究熱點[2, 3], 是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一個重要方向。

魚類健康養(yǎng)殖是指養(yǎng)殖魚類在某種水體條件下, 通過維持一個高質(zhì)量的水域環(huán)境, 投喂?fàn)I養(yǎng)平衡的飼料, 達(dá)到最佳的生長率、飼料轉(zhuǎn)化率、繁殖率和成活率的養(yǎng)殖[4], 其內(nèi)涵是保持或者恢復(fù)魚體健康[5], 因此如何評價魚體健康狀況尤為重要。健康魚體的生長速度、飼料利用效率、各器官和組織的各類指標(biāo)應(yīng)在正常、合理的范圍, 魚體能夠適應(yīng)所處環(huán)境, 并對環(huán)境的變化快速做出自我調(diào)節(jié),不會出現(xiàn)明顯的病理性變化、死亡等[6]。魚類能否保持健康的狀態(tài), 一方面取決于魚體自身的免疫力,還可能與機體內(nèi)外環(huán)境的平衡狀態(tài)相關(guān)。綜合起來, 魚類的健康, 除了無病以外, 主要體現(xiàn)在魚類機體體質(zhì)、行為能力和環(huán)境適應(yīng)力3個方面[5]。

長期以來, 我國水產(chǎn)養(yǎng)殖從業(yè)者們往往以有病或者無病來衡量魚類的健康狀況, 這種片面的觀點是造成我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)輕防重治的原因之一。同預(yù)測病害發(fā)生的原理相似[7], 魚類在從健康狀態(tài)向亞健康狀態(tài)轉(zhuǎn)變的過程中, 魚體的某些指標(biāo)隨之改變, 這些指標(biāo)就可以用來評判魚體的健康狀況。目前報道的魚體健康狀況評價方法主要包括人工現(xiàn)場觀察魚體形態(tài)、抽樣化驗血液和肝臟生理生化和免疫等指標(biāo)、免疫器官發(fā)育指數(shù)法分析、RNA/DNA比值分析、實驗攻毒等, 大致分為定性評價和定量評價2種, 而每種方法都存在各自的優(yōu)勢和缺點。

1 定性評價

定性評價是不采用數(shù)學(xué)的方法, 而是根據(jù)評價者對魚體狀態(tài)的觀察和分析, 直接對魚體健康狀況做出定性結(jié)論的判斷, 其中包括現(xiàn)場監(jiān)視和魚體抽樣化驗等。

1.1 現(xiàn)場監(jiān)視

現(xiàn)場監(jiān)視是最簡單直觀的魚體健康狀況評價方法。包括觀察養(yǎng)殖魚的體形、攝食狀態(tài)及游泳狀態(tài)。健康的魚體生長發(fā)育正常, 體形勻稱, 集群性強, 覓食力旺盛, 游動敏捷靈活[5]。但是現(xiàn)場監(jiān)視需要豐富的養(yǎng)殖經(jīng)驗, 其判斷標(biāo)準(zhǔn)還缺乏客觀性,一些不明顯的變化沒有被監(jiān)視到就可能給養(yǎng)殖場帶來巨大損失。

圖像處理技術(shù)借用計算機圖像處理技術(shù)對魚體健康狀況進行自動診斷, 實現(xiàn)對養(yǎng)殖現(xiàn)場中魚類的健康狀況進行實時監(jiān)視, 具有快速、簡易、成本低、準(zhǔn)確等優(yōu)點[8]。盧煥達(dá)等[9]提出了一種基于計算機視覺的魚類行為自動監(jiān)測方法, 通過監(jiān)測魚類體色與游動速度的變化, 自動發(fā)現(xiàn)由于應(yīng)激或疾病等引起的魚類行為異常。魚類的生長和攝食節(jié)律也可以通過計算機自動監(jiān)測[10]。這些研究對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)實施水產(chǎn)生物的自動化監(jiān)測具有借鑒意義。

1.2 魚體抽樣化驗

魚體抽樣化驗包括體表觀察、肝胰臟觀察、切片分析等。體表觀察只能對養(yǎng)殖魚類的健康狀況進行初步的評價, 是通過觀察體表顏色、魚體鱗片的完整和光亮程度、體表黏液的多少以及身體病態(tài)特征等一系列外貌特征作為判斷健康狀況的依據(jù)[6]。肝胰臟是水產(chǎn)動物重要的代謝器官, 肝胰臟的顏色和質(zhì)地也是反映魚體健康的重要指標(biāo)[11]。組織切片分析是將肝臟、消化道等組織材料經(jīng)過一系列的處理, 在顯微鏡下進行組織學(xué)檢測。通過肝臟和腸道的切片可觀察和分析魚體的健康狀況[12]。相對于體表觀察和肝胰臟觀察, 組織切片分析能更準(zhǔn)確可靠的評價魚體的健康狀況, 但其操作比較復(fù)雜而且需要一定的專業(yè)知識。

2 定量評價

定量評價通過數(shù)據(jù)客觀真實地反映魚體的生長及發(fā)育狀況, 結(jié)果相較于定性評價更加可靠, 具有客觀化、標(biāo)準(zhǔn)化和精準(zhǔn)化等優(yōu)點, 包括形體指標(biāo)分析、血液生理生化分析、免疫力指標(biāo)檢測、指數(shù)法分析、RNA/DNA比值分析、人工攻毒檢測等。

2.1 生理生化分析

血液生理生化分析血液生理生化分析是通過測定和分析血液中相關(guān)生理生化指標(biāo), 對被檢驗動物的健康狀況做出評價, 具有簡便、快捷等優(yōu)點, 并且可以直接在活體上取樣, 是評價魚體健康的可靠方法之一。血液生理生化分析主要包括血液常規(guī)指標(biāo)檢測和血清生化指標(biāo)檢測。

血液常規(guī)指標(biāo), 如紅細(xì)胞數(shù)量、紅細(xì)胞比值、血紅蛋白濃度等, 作為魚體健康評價方法, 已經(jīng)用于檢測如病害、重金屬污染、缺氧、高密度養(yǎng)殖等不同脅迫條件下魚體的生理變化[13, 14]。除常規(guī)的分析化學(xué)檢測外, 還可以通過血涂片分析了解血液紅細(xì)胞比例、紅細(xì)胞形態(tài)、白細(xì)胞數(shù)量及比例等, 進而了解魚體的生理狀態(tài)。在虹鱒飼料中添加瑪咖塊莖, 能夠提高其血液白細(xì)胞數(shù)量, 改善魚體健康狀況, 進而增加養(yǎng)殖魚的存活率[15]。另外, 血液淋巴細(xì)胞的降低則會引起免疫抑制, 導(dǎo)致魚體更易感染病原[16]。然而, 影響血液指標(biāo)的因素很多,比如養(yǎng)殖魚的種類、性別、規(guī)格、饑餓狀態(tài), 養(yǎng)殖水體水質(zhì)、溫度等, 不同的研究之間很難進行比較。比如饑餓狀態(tài)的虎利齒脂鯉(Hoplias malabaricus)血液紅細(xì)胞和白細(xì)胞都有所下降[17], 這就限制了該指標(biāo)作為魚體健康狀況評價依據(jù)的使用。

血清生化指標(biāo), 包括血清總蛋白、尿素氮、葡萄糖、總膽固醇和甘油三酯含量, 堿性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(AST)和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性等。和血液指標(biāo)相比, 血清生化指標(biāo)可以更好地反映免疫刺激物對魚體的影響[18, 19], 其與魚體抗病力的關(guān)系也被廣泛研究[20, 21]。比如血清總蛋白、葡萄糖、尿素氮和總膽固醇和甘油三酯含量被廣泛用于研究不同的飼料成分對魚體生理狀態(tài)的影響[22, 23]。AST和ALT活性可以用來指示化學(xué)或者脂質(zhì)過氧化作用造成的肝損傷[24]。鱸(Lateolabrax japonicus)對膽管炎癥的反應(yīng)造成血清ALP活性的提高[25]。已有研究嘗試篩選能夠用于評價魚體的健康狀況的血清生化指標(biāo)[21, 26]。通過研究血清生化指標(biāo)和黃尾魚(Seriola quinqueradiata)感染細(xì)菌后的死亡率之間的關(guān)系, 進而研究可評價魚體健康狀況的可靠的血清生化指標(biāo), 結(jié)果表明血清膽固醇含量與魚體抗病力有一定相關(guān)關(guān)系, 血清膽固醇含量較低的魚更易感病[21]。研究發(fā)現(xiàn), 高密度養(yǎng)殖的真鯛(Pagrus major)血清膽固醇含量明顯較低, 感染虹彩病毒后死亡率增加[26], 說明血清膽固醇的含量可以用于評價魚體抗病力。目前血清生化指標(biāo)是較有效的魚體健康評價方式, 但需要專業(yè)人員操作。

免疫力指標(biāo)檢測魚體免疫力與魚體健康狀況息息相關(guān)。參與魚類非特異性免疫反應(yīng)的因子主要包括巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和細(xì)胞毒性細(xì)胞等一些具有吞噬作用的細(xì)胞, 以及介導(dǎo)一系列免疫或應(yīng)激反應(yīng)的蛋白分子, 如補體、細(xì)胞因子、趨化因子及溶菌酶和抗菌肽等[27]。這些免疫因子的含量,作為免疫力指標(biāo)已被廣泛用于評價魚體健康研究[28—33]。但是在這些研究中, 由于缺失標(biāo)準(zhǔn)化的評價方法, 導(dǎo)致不同的研究結(jié)果之間沒有一致性, 甚至出現(xiàn)相悖的情況。如在益生菌對魚體健康和免疫力的影響研究中, Aly等[35]和Wang等[34]發(fā)現(xiàn), 芽孢桿菌等益生菌的投喂或添加可以顯著提高羅非魚的溶菌酶活性, 但在另外一個研究中, 芽孢桿菌的添加并沒有影響羅非魚溶菌酶的活性[36]。這說明目前經(jīng)常測定的免疫指標(biāo)還不具備通用性, 常用的魚體免疫指標(biāo)檢測技術(shù)仍需提高[37]。在生產(chǎn)上,魚體健康狀況評價十分重要。因此, 在以免疫指標(biāo)作為魚體健康狀況評價方法的情況下, 免疫指標(biāo)的檢測方法必須是規(guī)范化的, 要有良好的靈敏度、可靠性和易用性[38]。

肝臟生理生化分析肝臟在魚體健康中占重要地位, 酶的合成與分泌是其主要功能之一, 參與排泄、代謝、解毒和營養(yǎng)吸收等重要生理功能。魚體組織中的轉(zhuǎn)氨酶(AST和ALT)參與氨基酸代謝, 乳酸脫氫酶(LDH)將丙酮酸催化生成乳酸, 這3種酶活性的變化可以反應(yīng)肝的功能狀態(tài)[39], 當(dāng)肝臟細(xì)胞受到了損害時, 這些酶從肝細(xì)胞中釋放出來,進入血液系統(tǒng), 導(dǎo)致肝組織中酶活性降低、血清中酶活性增加[40]。肝臟抗氧化酶活性, 包括過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等也廣泛用于魚體健康評價[41, 42]。該方法也需專業(yè)人員操作。

RNA/DNA 比值分析RNA濃度是測定生物生長和代謝率的指標(biāo), 而DNA濃度是體現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目的指標(biāo), 細(xì)胞中DNA含量對環(huán)境條件的變化并不敏感, 因此RNA/DNA比值反映了動物的代謝活動,可作為評價魚類健康狀況的潛在指標(biāo)。由于RNA/DNA比值的變化是體內(nèi)蛋白質(zhì)合成狀況的體現(xiàn), 因此, 即使在魚體的體長、體重尚未明顯變化時,RNA/DNA比值可作為仔魚生長速度的指標(biāo)[43]。RNA/DNA比值具有種屬特異性[44], 被認(rèn)為是一種極有效的營養(yǎng)指標(biāo), 能準(zhǔn)確地反映魚類的營養(yǎng)狀態(tài)[45, 46]。但這種評價方式會受到核酸提取的質(zhì)量影響, 且需要專業(yè)人員操作。

2.2 指數(shù)法分析

目前常見的包括形體指數(shù)、免疫器官指數(shù)和魚體健康指數(shù)3種。

形體指數(shù)形體指標(biāo)主要有體重/體長、肥滿度等。通過研究鰱(Hypophthalmichthys molitrix)、鳙(Aristichthys nobilis)、草魚(Ctenopharyngodon idellus)、鳊(Parabramis pekinensis)等魚種的體重與體長的相關(guān)關(guān)系, 得出魚種的體重大小能較正確的反映出魚種質(zhì)量的優(yōu)劣[47]?；谥悄苁謾C的發(fā)展, 陳柏松等[48]建立了一個基于安卓智能手機的黃鱔(Monopterus albus)體長、體重及肥滿度的測定系統(tǒng), 可用于野外實地實時測量。但這些形體指標(biāo)的比較主要在試驗組之間進行, 需要提前了解比較組的養(yǎng)殖條件和養(yǎng)殖規(guī)格, 統(tǒng)計養(yǎng)殖魚類健康狀況良好時的各形體指標(biāo)的變化范圍, 才能夠診斷狀態(tài)異常的魚類。

免疫器官指數(shù)免疫器官指數(shù)是反映免疫器官發(fā)育程度的重要指標(biāo), 在無明顯病變的情況下,一般來說免疫器官指數(shù)越高, 免疫器官發(fā)育越完善,機體的免疫力就越強[37]。免疫器官指數(shù)包括頭腎指數(shù)、胸腺指數(shù)、肝胰臟指數(shù)和脾臟指數(shù)等, 是指其重量占魚體總重量的比例。免疫器官指數(shù)常用于研究免疫增強劑對魚體健康的影響。如玉屏風(fēng)多糖添加量為0.8—1.6 g/kg時對草魚的肝胰臟指數(shù)無顯著影響, 當(dāng)添加量達(dá)到1.6 g/kg時, 試驗組的頭腎指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著高于對照組, 可以起到增強免疫的效果[49]。

魚體健康指數(shù)魚體健康指數(shù)(The fish health condition profile, HCP)最早用于評價虹鱒魚種的健康狀況[50], 包括對魚體外部特征如體長和體重的測量; 血液參數(shù)如血細(xì)胞比容、白細(xì)胞比容和血漿蛋白濃度的測量; 內(nèi)部器官如鰓、假鰓、胸腺形態(tài)學(xué)觀察和脾、肝、后腸、腎、腸系膜脂肪、膽囊膽汁的狀態(tài)評估等。該評價方法綜合了前文中的形態(tài)學(xué)分析和血液生理生化分析等。Novotny和Beeman[51]通過HCP對王鮭幼魚進行了健康評價,結(jié)果表明其胸腺的異常發(fā)育和過高的脂肪含量是受養(yǎng)殖密度影響, 但這些異?，F(xiàn)象和魚體抗病性不相關(guān)。劉猛等[6]根據(jù)草魚體表顏色、形體指標(biāo)、肝胰臟解剖圖、肝組織切片及肝功能和肝損傷酶學(xué)值等建立養(yǎng)殖了草魚健康評價指標(biāo)體系, 發(fā)現(xiàn)肥滿度、內(nèi)臟指數(shù)、肝胰臟指數(shù)、肝脂肪含量、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、甘油三酯、高密度脂蛋白-膽固醇和低密度脂蛋白-膽固醇10個指標(biāo)及其正常值范圍可以用來判定草魚的健康狀況。但健康指數(shù)的確立需要對不同的養(yǎng)殖魚類進行數(shù)據(jù)采集和統(tǒng)計分析, 工作量非常巨大。

2.3 人工攻毒檢測

人工攻毒可以直觀地評價魚體的抗病力, 進而評價魚體的健康狀況。近幾年的研究發(fā)現(xiàn), 非特異性免疫反應(yīng)的提高并不能完全反映出魚體的抗病力, 而人工攻毒可以更加直接有效的評價魚體的抗病力[29, 52, 53]。人工攻毒通常有浸泡和注射2種方式。浸泡可以更好地模擬自然感染病原菌的狀態(tài),注射法則可以更好的控制攻毒劑量。攻毒效果與病原菌菌株致病力的強弱、環(huán)境條件和操作手法等直接相關(guān)。采用半致死濃度進行魚體攻毒是目前常用的人工攻毒方法, 如果攻毒濃度過高, 則會導(dǎo)致累計死亡率提高, 導(dǎo)致實驗結(jié)果和魚體的健康程度的相關(guān)性降低。由于攻毒所用的菌種、菌株和劑量不同, 不同的研究結(jié)果往往也不具有可比性。

2.4 共生菌菌群指示法

由腸道、皮膚和鰓等組成的黏膜系統(tǒng)是魚類抵御外界有害環(huán)境的第一道屏障, 分布在黏膜上的共生菌群與該系統(tǒng)作用的發(fā)揮關(guān)系密切[54]。共生菌群落結(jié)構(gòu)的失衡可以顯著影響宿主的生理和免疫狀態(tài)[55]。當(dāng)魚體黏膜系統(tǒng)共生菌的組成處于相對穩(wěn)定的動態(tài)平衡時, 這些共生微生物對魚體健康有益, 而當(dāng)共生菌群中的有害微生物過度繁殖, 微生物的結(jié)構(gòu)平衡最終會被打破, 不利于魚體的健康和生長[56]。研究表明, 菌群的定植可以提高斑馬魚(Brachydanio rerio)仔魚的中性粒細(xì)胞數(shù), 誘導(dǎo)編碼促炎和抗病毒介質(zhì)基因的表達(dá), 提高魚體對病毒感染的抵抗能力[57], 還可以誘導(dǎo)斑馬魚腸道堿性磷酸酶的表達(dá), 調(diào)節(jié)腸道炎癥反應(yīng)[58]。對大菱鲆(Scophthalmus maximus)體表黏液的菌群結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn),健康大菱鲆的體表和垂死大菱鲆的體表細(xì)菌組成有很大差異, 比如發(fā)光桿菌屬細(xì)菌(Photobacterium angustum)和堅強芽孢桿菌(Bacillus firmus)等僅存在于健康魚的體表[59]。通過對比攻毒無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)前后的羅非魚皮膚和鰓的菌群結(jié)構(gòu), 發(fā)現(xiàn)存活的羅非魚體表菌群結(jié)構(gòu)和未感染病原前無顯著差異, 而垂死羅非魚的體表菌群多樣性下降, 其中弓形桿菌屬(Arcobacter)、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)和弧菌屬(Vibrio)等含量顯著下降[60]。黏膜共生菌菌群結(jié)構(gòu)特征能夠在一定程度上反映魚體的健康狀況, 兩者之間存在相關(guān)性。高通量測序技術(shù)的發(fā)展為了解魚體共生菌群提供了可能, 未來可以通過鑒定某種或者某一類細(xì)菌, 了解魚體的健康狀況, 篩選出魚體健康的指示菌群。

3 展望

魚體的健康狀況與養(yǎng)殖業(yè)效益直接相關(guān), 因此,魚體健康狀況的評價顯得尤為重要。通過分析某些指標(biāo)可以預(yù)判養(yǎng)殖魚類是否向亞健康狀態(tài)過渡,一旦出現(xiàn)異常, 能夠及時采取預(yù)防措施, 降低或者避免魚體發(fā)病的可能。綜合當(dāng)前研究結(jié)果, 發(fā)現(xiàn)單一的評價指標(biāo)在靈敏度和精確度上存在一定缺陷,很難通過單一指標(biāo)對魚體健康狀況進行全面評價。因此, 多指標(biāo)結(jié)合的評價方法將是未來研究的趨勢。

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)集約化、工廠化步伐的加快,建立靈敏精確的養(yǎng)殖魚體健康評價方法將是產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個重大需求。此外, 按養(yǎng)殖類型有針對性地監(jiān)測和評價, 建立適合池塘、水庫和湖泊等自然水體、工廠化養(yǎng)殖水體或網(wǎng)箱養(yǎng)殖的魚體健康評價方法也是未來的發(fā)展方向之一?；驕y序技術(shù)的飛速發(fā)展, 測序費用大大降低, 且能夠在短時間內(nèi)獲得分析結(jié)果, 快速知曉環(huán)境微生物和魚體黏膜免疫系統(tǒng)共生菌的組成和變化, 以預(yù)判環(huán)境和魚體的健康狀況。計算機圖像處理技術(shù)能夠?qū)崟r觀測魚體行為, 及時發(fā)現(xiàn)異常個體, 結(jié)合基因測序技術(shù),理論上能夠客觀準(zhǔn)確的評價魚體及環(huán)境健康狀況,為提前做好病害防控和養(yǎng)殖環(huán)境的改善提供可能。