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布魯氏菌常導(dǎo)致家畜感染，進(jìn)而感染人類引起布魯氏菌病，以羊種布魯菌為主[1]。全球每年新發(fā)布病約50萬例[2]，布病臨床癥狀不典型，慢性化率高，長期不愈并累多關(guān)節(jié)臟器，使患者反復(fù)遭受疾病折磨[3-4]，給很多國家的人類健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成巨大的傷害[5-6]。研發(fā)針對布魯氏菌的疫苗可以有效減少布病的發(fā)病，但目前的滅活疫苗和減毒活疫苗還存在效果不佳和不良反應(yīng)多等不足[7]。OMP16蛋白是布魯氏菌的一種外膜蛋白，具有很好的免疫原性，本研究利用生物信息學(xué)分析手段，對OMP16蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，預(yù)測可能的B和T細(xì)胞的優(yōu)勢抗原表位，為布魯氏菌診斷和疫苗研究的提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1氨基酸序列 從NCBI網(wǎng)站中的protein(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)中獲取B.melitensis的OMP16蛋白的氨基酸序列(GenBank: AAD33089.2)，序列如下：Mgyfpswrltsnavvlpderlpaaaavpmgiqhllamsgstivapllmgfdpnvavffsgig-tllfflitagrvpsylgssfafiavviaatgysgsgpnpniaialggiiac-galysliglivmflgtgwveklmppavtgaigvsiglnlapvaigqlk-gtgahtsialltvlcmamisaygprgtrrlsvlfallfgyllvliagngl-givpgidftavknaawfglphfttpafnwqavtliapvaivlvaenlg-hikalgsitgrnmdgyigrgffsdglatmisgagggtgvttyaenig-vmamtkvystlifviaaimalilgmspkfgailqtipapvlaglavsv-fgliasamariwivnkvdfadsrnlftvgvalifgagdftlnignfalg-giatstlaalvlyqllgigrsds

1.1.2生物信息學(xué)分析軟件 蛋白理化分析：ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)；二級結(jié)構(gòu)分析：DNAstar 7.2軟件的Protein模塊，SOMPA在線分析軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)；三級結(jié)構(gòu)分析：Phyre2在線分析(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html)； Rasmol 2.7.2.1；T和B表位分析：IEDB(http://tools.immuneepitope.org/mhci/)、(http://tools.immuneepitope.org/mhcii/)、(http://tools.immuneepitope.org/main/bcell/)、SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de/bin/mhcserver.dll/epitopeprediction.htm)、ABCpred Prediction(http://www.imtech.res.in/raghava/abcpred/)、BepiPred 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)、DNAstar 7.2。

1.2 方 法

1.2.1利用ProtParam進(jìn)行OMP16蛋白理化性質(zhì)預(yù)測 分析蛋白的氨基酸組成、分子量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)和疏水性等理化性質(zhì)。

1.2.2利用DNAstar軟件Protein模塊和SOMPA分析OMP16蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu) 采用Gramier-Robson和Chou-Fasman方法預(yù)測OMP16蛋白α螺旋，β折疊，β轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的二級結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

1.2.3利用Phyre2和Rasmol蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)分析 將OMP16氨基酸序列錄入Phyre2在線服務(wù)器，分析蛋白氨基酸序列并組合模板，構(gòu)建OMP16蛋白的三級結(jié)構(gòu)并生成pdb數(shù)據(jù)文件，用Rasmol軟件讀取數(shù)據(jù)文件并對三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.2.4B和T表位預(yù)測分析 利用IEDB、DNAStar、ABCpred和BepiPred預(yù)測OMP16蛋白的B細(xì)胞抗原表位；利用SYFPEITHI和IEDB進(jìn)行OMP16蛋白的T抗原表位預(yù)測。MHC-I(The major histocompatibility complex class-I)分子選擇HLA-A*1101，MHC-II分子選擇HLA-DRB1*0701進(jìn)行預(yù)測。通過比較分析最終OMP16蛋白的B細(xì)胞及T細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位。

2 結(jié) 果

2.1理化性質(zhì) ProtParam顯示OMP16蛋白有426個氨基酸序列，蛋白分子質(zhì)量為43678.81 Daltons；理論等電點(diǎn)為9.72；原子組成為C2026H3209 N499O536S17；不穩(wěn)定系數(shù)為26.57，歸類為穩(wěn)定蛋白；平均親水系數(shù)GRAVY：0.981，歸類為疏水性蛋白。

2.2二級結(jié)構(gòu) 經(jīng)DNAstar軟件分析OMP16蛋白的二級結(jié)構(gòu)結(jié)果見圖1。OMP16蛋白的α-螺旋，β-折疊，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的具體區(qū)域位置見表1。

SOPMA服務(wù)器在線分析OMP16二級結(jié)構(gòu)檢測顯示：α-螺旋40.61%，β-折疊19.01%，β-轉(zhuǎn)角8.45%，無規(guī)則卷曲31.92%。結(jié)構(gòu)見圖2。

2.3三級結(jié)構(gòu) 為了直觀的分析蛋白質(zhì)的構(gòu)象結(jié)構(gòu)，利用Phyre2服務(wù)器在線分析OMP16蛋白的三級結(jié)構(gòu)，分析發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的蛋白序列覆蓋率為92%，可信度達(dá)到100.0%。建模后，通過RasMol軟件分析預(yù)測OMP16蛋白的三級結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示OMP16蛋白結(jié)構(gòu)成環(huán)狀，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，有較多的β-折疊位于蛋白質(zhì)的中部。上下部有很多易于形成構(gòu)象抗原表位的結(jié)構(gòu)。結(jié)果見圖3。

圖1 DNAStar分析OMP16蛋白的二級結(jié)構(gòu)結(jié)果Fig.1 Secondary structure prediction results for the OMP16 protein by DNAStar

表1 DNAStar分析OMP16蛋白的二級結(jié)構(gòu)結(jié)果
Tab.1 Secondary structure prediction results for the OMP16 protein by DNAStar

方法α-螺旋β-折疊β-轉(zhuǎn)角無規(guī)則卷曲arnier-Robson18-33,170-177,221-226,254-263,303-315,320-328,356-366,373-37711-16,40-47,53-60,64-70,86-93,103-127,141-160,188-197,211-220,263-281,336-356,378-389,415-42136-39,59-62,71-73, 94-96,185-187,207-209,232-23461-64,97-101,128-130,163-164,183-185,234-236,292-297Chou-Fasman16-27,32-36,133-137,150-153,218-228,257-26440-44,54-69,83-92,104-127,137-148,165-180,188-205,211-222,239-255,264-269,295-330,336-359,361-372,378-387,402-4214-7,10-13,27-31,37-41,51-54,70-77,79-82,94-97,99-102,128-131,162-165,184-187,206-210,270-274,276-284,291-294,332-335,374-378,388-392,395-399,422-426

2.4 B和T細(xì)胞表位

2.4.1B細(xì)胞表位的預(yù)測 IEDB在線表位預(yù)測軟件結(jié)果(圖4)顯示：線性表位由高到低分別是263-307，1-30，210-228，332-348，91-105，130-145(圖4A)。β-轉(zhuǎn)角由高到低分別是92-103，290-299，72-82，265-285，181-190，159-167,182-190(圖4B)。表面可及性由高到低分別，182-191，16-22，297-303，92-102，267-273，309-314，369-379，3-11(圖4C)?？伤苄杂筛叩降头謩e為92-102，290-305，183-191，158-168，37-42，372-379，16-21(圖4D)?？乖杂筛叩降鸵来螢?43-256,191-206,410-419,151-158,83-91,339-358,314-327,106-126(圖4E)。親水性由高到低依次是91-103，284-306，265-277，159-168，181-191，369-380，72-80，8-23(圖4F)。

利用BepiPred 1.0b Server和ABCpred Prediction Server預(yù)測分析B細(xì)胞表位，尋找共同預(yù)測的表位，結(jié)果見表2。然后結(jié)合IEDB和DNAStar顯示的OMP16外模蛋白結(jié)構(gòu)的線性表位，β-轉(zhuǎn)角，親水性，可塑性和表面可及性的特點(diǎn)，最終確定B細(xì)胞表位。

圖2 SOPMA分析OMP16蛋白的二級結(jié)構(gòu)結(jié)果Fig.2 Secondary structure of OMP16 protein predicted by SOPMA

注：OMP16蛋白的三級結(jié)構(gòu)由Phyre構(gòu)建，其中紅色為α-螺旋，黃色為β-折疊，藍(lán)色為無規(guī)則卷曲，其他為白色。Cartoons模式(A)圖為正面，(B)圖為背面；Stick模式(C)圖為正面，(D)圖為背面；Spacefill模式(E)圖為正面，(F)圖為背面。圖3 OMP16三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig.3 Tertiary structure prediction results for the OMP16 protein

A：線性表位；B：β-轉(zhuǎn)角 ；C：表面可及性；D：可塑性；E：抗原性；F：親水性圖4 IEDB分析預(yù)測結(jié)果Fig.4 Result of IEDB prediction

表2 BepiPred和ABCpred預(yù)測的B細(xì)胞表位結(jié)果
Tab.2 Results of B cell epitopes predicted by BepiPred and ABCpred

BepiPred 1.0b ServerABCpred Prediction Server 位置序列得分位置序列得分19-24ERLPAA0.9639-55GSTIVAPLLMGFDPNV0.9693-102GYSGSGPNPN2.2786-102AVVIAATGYSGSGPNP0.95137-143PPAVTGA0.72326-342ALILGMSPKFGAILQT0.9160-166LKGTGAH0.84273-289DGYIGRGFFSDGLATM0.9183-187YGPRGT1.20177-193MAMISAYGPRGTRRLS0.88269-275GRNMDGY0.44139-155AVTGAIGVSIGLNLAP0.88290-301SGAGGGTGVTT1.58294-310GGTGVTTYAENIGVMA0.85

2.4.2T細(xì)胞表位預(yù)測 利用SYFPEITHI和IEDB在線表位預(yù)測軟件，HLA等位基因選擇HLA-A*1101預(yù)測分析CTL細(xì)胞表位，選擇HLA-DRB1*0701挑選重疊預(yù)測的Th表位。結(jié)果見表3。

2.4.3經(jīng)過篩選和比較最終確定了4個B細(xì)胞的優(yōu)勢表位，5個CTL和5個Th細(xì)胞優(yōu)勢表位，結(jié)果見表4。

表3 SYFPEITHI和IEDB預(yù)測的T細(xì)胞表位結(jié)果
Tab.3 Results of T cell epitopes predicted by SYFPEITHI and IEDB

表位SYFPEITHIIEDB位置序列分?jǐn)?shù)位置序列百分位等級CTL表位408STLAALVLY23281FSDGLATMI0.369ITAGRVPSY2258FSGIGTLLF0.45267ITGRNMDGY21408STLAALVLY0.65193VLFALLFGY18267ITGRNMDGY0.65293GGGTGVTTY17373FADSRNLFT0.786AVVIAATGY16191LSVLFALLF0.75109GIIACGALY1669ITAGRVPSY0.8175LCMAMISAY16380FTVGVALIF1.25373FADSRNLFT13175LCMAMISAY1.3Th表位4FPSWRLTSNAVVLPD32316TLIFVIAAIMALILG0.2232QHLLAMSGSTIVAPL3061IGTLLFFLITAGRVP0.25352VSVFGLIASAMARIW28310MTKVYSTLIFVIAAI0.26180ISAYGPRGTRRLSVL2662GTLLFFLITAGRVPS0.463TLLFFLITAGRVPSY2429MGIQHLLAMSGSTIV0.5974VPSYLGSSFAFIAVV24311TKVYSTLIFVIAAIM0.61121GLIVMFLGTGWVEKL2463TLLFFLITAGRVPSY0.66307VMAMTKVYSTLIFVI243YFPSWRLTSNAVVLP0.76316TLIFVIAAIMALILG2430GIQHLLAMSGSTIVA0.81

表4 B和T細(xì)胞優(yōu)勢表位
Tab. 4 B and T cell dominance epitopes

表位方法位置序列B細(xì)胞表位ABCpred93-102GYSGSGPNPNBepiPred183-187YGPRGTIEDB294-301GGTGVTTYDNAstar273-289DGYIGRGFFSDGLATMCTL細(xì)胞表位69-77ITAGRVPSY175-183LCMAMISAYSYFPEITHI267-275ITGRNMDGYIEDB373-381FADSRNLFT408-416STLAALVLYTh細(xì)胞表位4-20FPSWRLTSNAVVLPD32-46QHLLAMSGSTIVAPLSYFPEITHI63-77 TLLFFLITAGRVPSYIEDB316-330TLIFVIAAIMALILG352-366VSVFGLIASAMARIW

3 討 論

布魯氏菌病是全球很常見的人獸共患病，有160多個國家和地區(qū)受到布病的威脅。布魯氏菌有10個種，造成人感染的主要是羊種、牛種和豬種布魯氏菌，而羊種引起布魯氏菌病最為常見[1,8]。感染布魯氏菌后可引起波浪形發(fā)熱并造成各種關(guān)節(jié)臟器損害，包括關(guān)節(jié)炎，脊椎炎，骶髂關(guān)節(jié)炎，心內(nèi)膜炎和神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。由于布魯氏菌缺乏外毒素、菌毛等良好抗原表位，LPS也表現(xiàn)為低反應(yīng)性。這些特點(diǎn)使布魯氏菌發(fā)生了免疫逃避，并在宿主細(xì)胞中存活以建立持久感染[9]。布魯氏菌疫苗這一很好的控制手段由于存在安全性等問題，還需要進(jìn)行深入的研究[10]。

布魯氏菌細(xì)胞膜有3層，OMP16位于細(xì)胞膜外側(cè)，是外膜結(jié)構(gòu)中必不可少的成分。與OMP10和OMP19屬于第一組外膜蛋白[11]。根據(jù)之前的研究認(rèn)為OMP16具有很強(qiáng)的免疫原性，可以激活TLR4-MyD88信息轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，刺激機(jī)體產(chǎn)生足夠強(qiáng)度的免疫應(yīng)答[12-13]。與傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行表位預(yù)測相比，生物信息學(xué)技術(shù)使蛋白結(jié)構(gòu)分析和表位的預(yù)測變得更加高效和準(zhǔn)確[14]，目前已成為很多表位和疫苗研究首選方法[15-16]，也常用于布魯氏菌表位預(yù)測和疫苗的研制[17]。本研究使用多個軟件對OMP16蛋白進(jìn)行多角度的分析，分析結(jié)果顯示OMP16蛋白總體是一個結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的疏水性蛋白，二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占40.61%，β-折疊占19.01%，β-轉(zhuǎn)角占8.45%，無規(guī)則卷曲占31.92%。Phyre構(gòu)建的三級結(jié)構(gòu)顯示OMP16蛋白具有多個可以形成表位的空間結(jié)構(gòu)。α-螺旋和β-折疊是位于蛋白內(nèi)部的剛性結(jié)構(gòu)，較難形成表位，β-轉(zhuǎn)角區(qū)域和無規(guī)則卷曲區(qū)域是很好的形成抗原表位區(qū)域。親水性強(qiáng)、可及性和可塑性較好的區(qū)域也是形成表位的優(yōu)勢區(qū)域[18]。OMP16的蛋白結(jié)構(gòu)顯示其具有很好的表位預(yù)測價值。

本研究預(yù)測的4個B細(xì)胞優(yōu)勢表位均是在BepiPred和ABCpred共同預(yù)測表位分?jǐn)?shù)較高的基礎(chǔ)上，結(jié)合IEDB和DNAStar預(yù)測的親水性等參數(shù)，除外在α-螺旋和β-折疊區(qū)域的表位，通過選取兩種預(yù)測軟件重合的區(qū)域最終確定93-102，183-187，273-289，294-301為B細(xì)胞優(yōu)勢表位。其中3個位于無規(guī)則卷曲區(qū)域，1個位于β-轉(zhuǎn)角區(qū)域。BepiPred軟件通過隱馬爾可夫模型和傾向量表法來預(yù)測預(yù)測B細(xì)胞表位[19]，而ABCpred軟件是通過基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的一種預(yù)測方法[20]，都具有很較高的預(yù)測精度。本次研究著重于線性B細(xì)胞表位的預(yù)測，因?yàn)樗鼈兏m用于開發(fā)基于肽的疫苗和診斷試劑[21]。

T細(xì)胞包括細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和輔助性T細(xì)胞(Th)。CTL識別內(nèi)源性抗原，可以與MHC Ⅰ類分子結(jié)合，Th細(xì)胞識別MHC II類分子。Th細(xì)胞通過分化為不同的Th亞群來抵御布魯氏菌，Th1細(xì)胞激活并產(chǎn)生IFN-r等細(xì)胞因子發(fā)揮著關(guān)鍵的殺菌作用。同時布魯氏菌是一種胞內(nèi)感染菌，預(yù)測CTL和Th細(xì)胞表位均對布魯氏菌清除具有重要意義。本研究使用SYFPEITHI和IEDB進(jìn)行了分析和比較[22-23]，HLA等位基因選擇新疆地區(qū)人群出現(xiàn)頻率較高的HLA-A*1101和HLA-DRB1*0701[24]進(jìn)行預(yù)測，最終篩選出CTL和Th細(xì)胞優(yōu)勢表位各5個。

本研究預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)和T、B表位均采用多種方式在多個角度進(jìn)行了分析和預(yù)測。T、B表位通過比較分析尋找兩種軟件的重疊區(qū)域，有效的規(guī)避了單一軟件預(yù)測正確率不是很高的缺陷，可以提高預(yù)測結(jié)果的正確率?？傊覀冋J(rèn)為篩選出的OMP16蛋白的B和T細(xì)胞優(yōu)勢表位具有很好的免疫原型，能夠?yàn)檫M(jìn)一步疫苗開發(fā)和布病診斷提供一定的理論基礎(chǔ)。

利益沖突：無