合成生物學(xué)新技術(shù)在基因表達(dá)精確調(diào)控和提高脂肪酸合成效率方面的應(yīng)用

王毓舒， 賀 林， 馬 鋼

(上海交通大學(xué) Bio-X研究院 SJTU-BioX-Shanghai國(guó)際基因工程機(jī)器大賽團(tuán)隊(duì)，上海 200240)

基因表達(dá)調(diào)控是一個(gè)對(duì)生物體內(nèi)的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)控制的極其復(fù)雜的過程，是生物體內(nèi)細(xì)胞分化、形態(tài)發(fā)生和個(gè)體發(fā)育的分子基礎(chǔ)，受轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平和翻譯后水平等不同層次的影響.基因表達(dá)調(diào)控可以使細(xì)胞中的基因表達(dá)在時(shí)間以及空間上處于有序的狀態(tài)，并且對(duì)環(huán)境條件的變化有所反應(yīng).人們通常利用外源分子元件，或者直接利用內(nèi)源性元件，對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行不同程度的調(diào)控，但外源分子元件在底盤細(xì)胞中的運(yùn)用往往缺乏穩(wěn)定性，而內(nèi)源性元件則存在著本底噪聲大、結(jié)構(gòu)未知、調(diào)控信號(hào)不明等問題.如何減少生物元件間的干擾，簡(jiǎn)化分子元件作用模式，充分利用生物底盤來重新編程和合成穩(wěn)定、高效的人工代謝網(wǎng)絡(luò)，是科學(xué)家們普遍關(guān)心的問題.

合成生物學(xué)是生命科學(xué)在21世紀(jì)剛剛發(fā)展出來的一個(gè)分支學(xué)科，其目的在于利用合成的 DNA 理性地構(gòu)建新的表達(dá)元件、功能模塊、基因線路，甚至是全新的生命體.合成生物學(xué)采用“適配”以及系統(tǒng)進(jìn)化的概念，通過調(diào)節(jié)不同模塊的表達(dá)強(qiáng)度，使功能模塊之間，或者功能模塊與底盤細(xì)胞之間進(jìn)行適配，從而實(shí)現(xiàn)代謝流最優(yōu)化，讓人工生物系統(tǒng)進(jìn)行高效運(yùn)轉(zhuǎn).基于合成生物學(xué)的思維和手段，科學(xué)家們構(gòu)建了用于基因表達(dá)調(diào)控的元器件，并將其廣泛地應(yīng)用于疾病診斷與治療、環(huán)境監(jiān)測(cè)與控制，以及高附加值化學(xué)物品的生物合成中.Shao等[1]基于光遺傳學(xué)技術(shù)，設(shè)計(jì)合成一種可由遠(yuǎn)紅光亮度來調(diào)控胰島素表達(dá)的定制化細(xì)胞，并將該細(xì)胞移植到糖尿病小鼠皮下，當(dāng)給予糖尿病小鼠遠(yuǎn)紅光照射時(shí)，就能夠激活體內(nèi)的定制化細(xì)胞表達(dá)鼠胰島素或人胰高血糖素樣肽-1的短變體，從而降低血糖濃度，并維持血糖穩(wěn)定.Dueber等[2]利用多細(xì)胞動(dòng)物的信號(hào)傳遞模塊，構(gòu)建一種蛋白質(zhì)支架，將多個(gè)酶分子進(jìn)行空間重構(gòu)，形成一個(gè)連續(xù)的反應(yīng)體系.通過配基數(shù)量的優(yōu)化，使幾種酶之間達(dá)到一個(gè)最優(yōu)的比例，從而使中間代謝物被快速利用，防止有毒代謝物積累.蛋白質(zhì)支架的應(yīng)用不僅降低了高遷移率群蛋白(HMG)對(duì)細(xì)胞的毒害作用，還將代謝流量提高了77倍[2].沙門氏菌(Salmonella)可分泌抗腫瘤蛋白，幫助機(jī)體清除腫瘤，但在正常的組織中表達(dá)會(huì)帶來副作用.基于沙門氏菌優(yōu)先在腫瘤組織中累積這一特性，Swofford等[3]在沙門氏菌中安裝了一種群體感應(yīng)線路，只有在沙門氏菌達(dá)到一定密度之后才會(huì)開啟抗腫瘤蛋白的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)治療蛋白在腫瘤組織中選擇性表達(dá)的目標(biāo).精準(zhǔn)調(diào)控在細(xì)胞調(diào)節(jié)通路和響應(yīng)復(fù)雜環(huán)境等方面具有十分重要的作用，利用理性設(shè)計(jì)的生物元件對(duì)生命體的代謝系統(tǒng)進(jìn)行精密控制具有重大的科學(xué)意義和社會(huì)價(jià)值.

近半個(gè)世紀(jì)以來，化石燃料使用量的增加導(dǎo)致溫室氣體排放的加劇，對(duì)地球生存環(huán)境造成不良影響.20世紀(jì)70年代提出了生物燃料的概念，以玉米及甘蔗為原料的生物乙醇和以棕櫚油為原料的生物柴油被用來替代化石燃料，但是這類生物燃料的開發(fā)也引發(fā)了針對(duì)因占用糧食和農(nóng)業(yè)用地進(jìn)行燃料生產(chǎn)所引發(fā)的社會(huì)和環(huán)境爭(zhēng)論[4].許多微生物擁有天然的生化代謝途徑，能夠?qū)⑸镔|(zhì)轉(zhuǎn)化為生物燃料的前體.中長(zhǎng)碳鏈(C8～C18)的烴醇類物質(zhì)具有與現(xiàn)有石油基產(chǎn)品更加匹配的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性能，因此是一種理想的替代性能源[5].烴醇類化合物可以經(jīng)脂肪酸分子的脫羧和酯化反應(yīng)獲得[6-8]，而脂肪酸合成途徑是生物生長(zhǎng)繁殖所必需的同化代謝途徑，因此，對(duì)微生物天然的脂肪酸合成途徑進(jìn)行改造已成為近年來生物燃料領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[9].值得注意的是，合成生物學(xué)技術(shù)的日臻成熟能夠幫助代謝工程學(xué)家更為科學(xué)合理地設(shè)計(jì)與底盤細(xì)胞相適配的功能模塊，平衡生物體內(nèi)的代謝流，提高人工生物系統(tǒng)的魯棒性[10-11]，極大地拓展了大腸桿菌脂肪酸的合成方式和應(yīng)用范圍.

基于大腸桿菌細(xì)胞中天然存在的生物元器件，上海交通大學(xué)iGEM團(tuán)隊(duì)開發(fā)了3種基因調(diào)控模塊，并將其應(yīng)用于脂肪酸合成途徑的調(diào)控和優(yōu)化上，實(shí)現(xiàn)自由脂肪酸產(chǎn)量的提升，展現(xiàn)人工生物模塊在構(gòu)建高效率人造細(xì)胞工廠方面的潛力和價(jià)值.

圖1 兩種調(diào)控系統(tǒng)中插入AGG數(shù)量與熒光素酶表達(dá)量的關(guān)系Fig.1 The relationship between inserted AGG number and luciferase expression level in both regulation system

1 稀有密碼子開關(guān)——翻譯水平上的精細(xì)調(diào)控

眾所周知，代謝網(wǎng)絡(luò)中的各個(gè)組分之間存在一個(gè)最適的化學(xué)計(jì)量比值，當(dāng)反應(yīng)體系在這種穩(wěn)定平衡狀態(tài)下工作時(shí)，能夠保證各個(gè)元件利用的最優(yōu)化和反應(yīng)的最大化.傳統(tǒng)的基因工程手段往往是通過啟動(dòng)子強(qiáng)度的調(diào)節(jié)和反式元件的應(yīng)用來調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)強(qiáng)度，當(dāng)需要在一個(gè)互相牽制緊密的代謝途徑中嚴(yán)謹(jǐn)?shù)夭倏馗鱾€(gè)基因的表達(dá)時(shí)，傳統(tǒng)方法會(huì)明顯暴露出操作的繁冗性和調(diào)控精度上的缺陷.由于對(duì)應(yīng)同源tRNA的匱乏[12-13]，稀有密碼子通常會(huì)阻礙蛋白表達(dá)，所以在代謝工程改造中通常會(huì)針對(duì)底盤細(xì)胞的密碼子偏好對(duì)所需調(diào)控的基因片段進(jìn)行密碼子優(yōu)化，以增強(qiáng)相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平[14-15].但是，生物體對(duì)密碼子的偏好性恰恰可以被用來開發(fā)調(diào)控基因表達(dá)的分子元件.在大腸桿菌中，AGG、AGA、CUA、AUA、CGA和CCC屬于稀有密碼子，它們?cè)诨蛑械南鄬?duì)位置決定這個(gè)基因的表達(dá)水平[16].因此，通過共表達(dá)或過表達(dá)這些tRNA可以有效地克服由稀有密碼子引起的基因表達(dá)障礙[17].利用大腸桿菌的稀有密碼子AGG、AGG對(duì)應(yīng)的同源tRNAArg(CUU)、終止密碼子TAG，可以建立一個(gè)作為“稀有密碼子開關(guān)”的分子器件，用來精確調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)強(qiáng)度[18].

1.1 受稀有密碼子開關(guān)調(diào)控的目標(biāo)基因的表達(dá)水平依賴于稀有密碼子的數(shù)量

為了實(shí)現(xiàn)稀有密碼子開關(guān)對(duì)目標(biāo)基因的調(diào)控，分別構(gòu)建含有2、4、6、8個(gè)稀有密碼子的熒光素酶表達(dá)菌株.AGG序列直接通過PCR加入到luc基因的第2個(gè)密碼子之后，緊接在luc基因后的是與AGG對(duì)應(yīng)的同源tRNAArg(CUU)，即argW基因，兩個(gè)基因簇同時(shí)受異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動(dòng)子T7的調(diào)控，其質(zhì)粒構(gòu)建見圖1(a).熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，Luc蛋白的熒光強(qiáng)度與稀有密碼子數(shù)量n的倒數(shù)存在線性函數(shù)關(guān)系，

RLU=a+b/n

(1)

式中：截距a和斜率b是常數(shù).報(bào)告基因的表達(dá)水平與插入的稀有密碼子數(shù)量之間存在一種正相關(guān)的線性關(guān)系，如圖1(b)和表1所示.為了探究稀有密碼子這一調(diào)控元件的穩(wěn)定性，改變tRNAArg(CUU)的位置，將argW基因置于組成型啟動(dòng)子trc之下，同時(shí)將帶有4、6、8個(gè)AGG的luc基因分別連接到組成型的弱啟動(dòng)子bla之后，報(bào)告基因和tRNAArg(CUU)存在于兩個(gè)獨(dú)立相容的質(zhì)粒系統(tǒng)中，tRNAArg(CCU)單獨(dú)受啟動(dòng)子trc調(diào)控，質(zhì)粒構(gòu)建見圖1(c).這樣設(shè)計(jì)是為了研究目標(biāo)基因的表達(dá)水平是否僅與稀有密碼子的數(shù)量有關(guān)， 而與啟動(dòng)子的強(qiáng)度或者與目標(biāo)基因和 tRNA 的相對(duì)位置無關(guān).首先對(duì)pET-bla-8AGGluc菌株進(jìn)行熒光定量，并以此熒光強(qiáng)度為基數(shù)推測(cè)pET-bla-4AGGluc和pET-bla-6AGGluc的Luc蛋白表達(dá)水平.蛋白表達(dá)量基于表1中熒光酶的相對(duì)亮度和8個(gè)AGG之間的比值進(jìn)行預(yù)測(cè).通過熒光素酶活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)pET-bla-4AGGluc和pET-bla-6AGGluc的表達(dá)水平與模擬值吻合度很高，見圖1(d)和表1，說明不同數(shù)量的稀有密碼子對(duì)目標(biāo)基因的調(diào)控效果可以通過模型進(jìn)行擬合推演，這一結(jié)果僅與稀有密碼子的數(shù)量有關(guān)，與對(duì)應(yīng)的tRNA的拷貝數(shù)無關(guān).因此，受到稀有密碼子開關(guān)調(diào)控的目標(biāo)基因的表達(dá)與稀有密碼子數(shù)量之間的這種線性關(guān)系是非常穩(wěn)定的，研究人員可以通過公式推導(dǎo)出所需的稀有密碼子數(shù)量，將基因表達(dá)調(diào)控到合適的強(qiáng)度.

表1 由不同的構(gòu)建類型得到的熒光素酶活性的相對(duì)比值Tab.1 The relative ratio of luciferase activities in different construction types

圖2 稀有密碼子元件對(duì)E.coli脂肪酸合成效率的優(yōu)化Fig.2 The optimization of fatty acids sythesis efficiency in E. coli by rare codon element

1.2 用稀有密碼子開關(guān)優(yōu)化大腸桿菌脂肪酸合成途徑

為了挖掘稀有密碼子開關(guān)在復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中的潛力，需要選擇一個(gè)具有清晰調(diào)控模式的代謝途徑作為改造對(duì)象.Yu等[19]對(duì)在體外對(duì)大腸桿菌脂肪酸合成途徑中脂肪酸合成酶系的催化動(dòng)力學(xué)關(guān)系進(jìn)行研究，通過在體外配制不同濃度的酶反應(yīng)體系，以丙二酸單酰輔酶A(Malonyl-CoA)為底物催化目的產(chǎn)物十六烷酸的合成，最終獲得脂肪酸合成的最優(yōu)催化體系，并確定當(dāng)FabG，F(xiàn)abI，F(xiàn)abZ和TesA’這4種酶的物質(zhì)的量(n)之比為 1∶10∶10∶30時(shí)，細(xì)胞合成脂肪酸效率最高.基于式(1)，可以推算出當(dāng)AGG的數(shù)量分別為8、4、1時(shí)，對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)量的比值將大約為1∶10∶30.因此，從理論上來說，在對(duì)應(yīng)基因fabG，fabI，fabZ，tesA’的起始密碼子后分別插入8、4、4、1個(gè)AGG，可以將這4種酶按照1∶10∶10∶30 (n∶n) 的比例進(jìn)行調(diào)節(jié)(該構(gòu)建名為4Z8G4IT).同時(shí)，構(gòu)建不受AGG調(diào)控的ZGIT組和各插入4個(gè)AGG的4Z4G4I4T組，將它們作為對(duì)照菌株，質(zhì)粒構(gòu)建見圖2(a)，其中數(shù)字表示緊接在相應(yīng)基因起始密碼子之后插入的AGG的數(shù)量.脂肪酸定量結(jié)果顯示，4Z8G4IT組的總脂肪酸濃度為 68.96 mg/L，幾乎是ZGIT組(37.17 mg/L)和4Z4G4I4T組(37.16 mg/L)的2倍，見圖2(b).盡管4Z4G4I4T組中4個(gè)酶的表達(dá)量受稀有密碼子開關(guān)的調(diào)控有所下調(diào)，但是脂肪酸合成的效率似乎與正常過表達(dá)的ZGIT組無明顯差異，而且不論是在總脂肪酸還是C14、C16、C18的組成上均與ZGIT組相近，其中WT為野生型(見圖 2(c)).通過比較這3組菌株的合成能力，再次證明了只有在保證代謝流平衡的條件下對(duì)多酶反應(yīng)進(jìn)行調(diào)控，才能實(shí)現(xiàn)酶催化效率的最大化，而稀有密碼子開關(guān)這一元件能夠通過簡(jiǎn)單地調(diào)整基本調(diào)控元件的數(shù)量來實(shí)現(xiàn)對(duì)多酶系統(tǒng)中不同基因的精細(xì)調(diào)控，對(duì)于研究體內(nèi)代謝途徑的酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，優(yōu)化微生物細(xì)胞工廠的生物合成效率具有廣泛的應(yīng)用前景和較大的應(yīng)用價(jià)值.

圖3 基于E. coli跨膜蛋白Lgt的膜蛋白元件設(shè)計(jì)示意圖Fig.3 The schematic diagram of the design of membrane protein element based on Lgt, an E. coli transmembrane protein

2 細(xì)胞膜支架——代謝反應(yīng)加速器

在代謝網(wǎng)絡(luò)改造、組裝及重建上，合成生物支架是一種行之有效的工具.人們?cè)诩?xì)胞中建立支架，將代謝反應(yīng)必需的幾種關(guān)鍵酶固定在支架上，從而將它們集中在某個(gè)特定空間內(nèi)，減少各個(gè)酶之間的距離，可以有效加快酶促反應(yīng)的速度[2, 20-21].人工支架的運(yùn)用能夠維持代謝途徑中酶與酶之間能量流的平衡狀態(tài)，減少中間產(chǎn)物的累積效應(yīng)，但由于構(gòu)建方式的局限性，使細(xì)胞內(nèi)支架的數(shù)量受到自身表達(dá)或拷貝水平的影響，在調(diào)控靈活性和穩(wěn)定性上無法達(dá)到理想狀態(tài)[22-23].作為保護(hù)細(xì)胞的一種天然屏障，細(xì)胞膜由磷脂雙分子層構(gòu)成，這種雙層結(jié)構(gòu)形成了一個(gè)相對(duì)固定的空間，其中發(fā)生相互作用的分子間的空間距離相對(duì)較小，且發(fā)生在細(xì)胞膜附近的反應(yīng)會(huì)由于產(chǎn)物在膜一側(cè)的累積效應(yīng)而加速產(chǎn)物的跨膜運(yùn)輸，有利于目的產(chǎn)物分泌到細(xì)胞外的介質(zhì)中.同時(shí)，細(xì)胞膜可以直接感應(yīng)外部環(huán)境以及細(xì)胞內(nèi)部的信號(hào)，為人工制造受特定信號(hào)調(diào)控的分子元件提供良好的平臺(tái).基于微生物細(xì)胞膜的這些特點(diǎn)，可以在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)膜這一天然的二維平面上搭建一種蛋白支架，通過將一個(gè)代謝反應(yīng)中的多個(gè)酶固定在細(xì)胞膜支架上，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定代謝流的加速[24].構(gòu)建細(xì)胞膜支架所需要的基本生物元件包括來源于大腸桿菌的一種內(nèi)源蛋白前脂蛋白二酯酰轉(zhuǎn)移酶(Lgt)[25]，一段SRP依賴的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的導(dǎo)向序列ssDsbA[26]，以及來源于后生動(dòng)物細(xì)胞的二聚體蛋白系統(tǒng)[27].

2.1 報(bào)告基因在細(xì)胞內(nèi)膜上的定位表達(dá)

為了驗(yàn)證錨定元件ssDsbA-LGT的定位功能，分別將編碼β-內(nèi)酰胺酶的lac基因和報(bào)告基因egfp連接在lgt的N-末端和C-末端，質(zhì)粒構(gòu)建見圖3(a).在Lgt的兩端分別連接功能蛋白β-內(nèi)酰胺酶和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)，ssDsbA序列負(fù)責(zé)將融合蛋白導(dǎo)向周質(zhì)空間.將得到的pETara-Anchor 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21細(xì)胞中，并且經(jīng)過L-阿拉伯糖誘導(dǎo)后用激光共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pETara-Anchor菌株在細(xì)胞邊緣具有明顯的綠色熒光，這說明細(xì)胞膜上聚集了大量成功表達(dá)的EGFP，從而證明了錨定元件ssDsbA-LGT具備將與之融合的蛋白分子定位在細(xì)胞膜上的功能[24].同時(shí)，為了探究錨定元件表達(dá)的最適誘導(dǎo)濃度，對(duì)在不同L-阿拉伯糖和氨芐青霉素濃度條件下的菌株生長(zhǎng)情況進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)L-阿拉伯糖的體積分?jǐn)?shù)為 0.2%時(shí)，菌株能夠耐受質(zhì)量濃度高達(dá)200 μg/mL的氨芐青霉素.通過熒光檢測(cè)和抗生素耐受實(shí)驗(yàn)，證明ssDsbA-LGT能夠?qū)⒛繕?biāo)蛋白定位在細(xì)胞內(nèi)膜的兩側(cè)空間，并且不會(huì)對(duì)目標(biāo)蛋白的生物學(xué)功能造成影響.

2.2 報(bào)告基因在細(xì)胞內(nèi)膜上的聚合表達(dá)

在初步實(shí)現(xiàn)將目標(biāo)蛋白定位在細(xì)胞內(nèi)膜上后，希望通過進(jìn)一步拉近上膜蛋白之間的空間距離，來改善代謝流.要實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，需在錨定元件中引入一種二聚體蛋白，這類二聚體蛋白由相互匹配的結(jié)合域和配基兩部分組成，選取來自小鼠的SH3、PDZ和來自大鼠的GBD這3種二聚體蛋白.EGFP被拆分成1EGFP和2EGFP兩部分，將它們分別與帶有不同二聚體蛋白結(jié)合域或配基的錨定元件的C-末端相連，質(zhì)粒構(gòu)建見圖3(b).通過熒光觀察可見：同時(shí)表達(dá)帶有聚合元件的1EGFP和2EGFP的菌株具有明顯的綠色熒光信號(hào)，不帶聚合元件的對(duì)照組則沒有信號(hào)，由此證明錨定元件與聚合元件的組合能夠?qū)⒛繕?biāo)蛋白分子在細(xì)胞內(nèi)膜上進(jìn)行聚攏[24].動(dòng)物細(xì)胞中存在很多具有類似功能的二聚體蛋白，通過構(gòu)建不同的錨定-聚合元件，能夠方便地利用細(xì)胞膜支架將多個(gè)酶分子串聯(lián)在一起，以提高細(xì)胞內(nèi)的酶促反應(yīng)效率.

NS—無顯著意義，*—P<0.1, **—P<0.01, ***—P<0.001圖4 不同表達(dá)模式的脂肪酸合成酶系對(duì)E. coli脂肪酸合成效率的影響Fig.4 The effects of fatty acid synthases with different expression pattern on fatty acid synthesis efficiency in E. coli

2.3 用細(xì)胞膜支架加速大腸桿菌脂肪酸合成途徑代謝流

基于DNA、RNA、蛋白質(zhì)的人工支架通常是通過將生化反應(yīng)所需要的多個(gè)酶分子固定在支架上，來優(yōu)化特定代謝途徑的反應(yīng)效率，提高特定產(chǎn)物的生產(chǎn)速率.創(chuàng)造細(xì)胞膜支架的目的也在于此.為了驗(yàn)證其加速代謝流的功能，選擇FabI，F(xiàn)abZ，F(xiàn)abG和TesA’這4種在大腸桿菌脂肪酸合成途徑中起關(guān)鍵作用的酶分子作為改造對(duì)象，并構(gòu)建4組具有不同脂肪酸合成酶表達(dá)模式的工程化菌株，分別為膜上聚合組(MBF)、膜上自由組(MF)、胞內(nèi)聚合組(CBF)、胞內(nèi)自由組(CF).脂肪酸合成系統(tǒng)模式見圖4(a)：MBF組中的4種酶在膜上聚合；MF組在膜上自由表達(dá)；CBF組將4種酶在胞質(zhì)中聚合；胞質(zhì)表達(dá)CF組作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組.借助氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GCMS)對(duì)這4組工程化菌株合成的游離脂肪酸的構(gòu)成進(jìn)行分析，定量結(jié)果顯示：MBF和MF在總脂肪酸產(chǎn)量上沒有明顯差異，但優(yōu)于CBF和CF，見圖4(b).脂肪酸合成酶系是否在細(xì)胞膜上聚合似乎對(duì)脂肪酸產(chǎn)量影響不大，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是與廣闊的胞質(zhì)空間相比，細(xì)胞內(nèi)膜是一個(gè)相對(duì)緊湊的空間，被固定在上面的蛋白分子之間的空間距離已經(jīng)足夠近，以致不需要額外借力就能夠?qū)崿F(xiàn)酶促反應(yīng)的加速.同時(shí)，當(dāng)脂肪酸合成酶系在胞質(zhì)內(nèi)聚合表達(dá)時(shí)，工程菌的總脂肪酸濃度要高于自由表達(dá)組，這與此前報(bào)道的蛋白支架系統(tǒng)對(duì)代謝流加速[24]的效果是一致的.

另外，對(duì)4組菌的胞外和胞內(nèi)脂肪酸豐度進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：MBF和MF組相比于CBF和CF組而言能產(chǎn)生更多的胞外脂肪酸；不論是聚合組還是自由組，脂肪酸合成酶系的上膜表達(dá)均能顯著提升胞外脂肪酸的濃度(MBF/CBF為 5.52 倍，MF/CF為 3.77 倍)，見圖4(c).這是因?yàn)閹в屑?xì)胞膜支架的工程菌所合成的脂肪酸被富集在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，相對(duì)于胞外的低濃度環(huán)境形成一個(gè)較大的濃度梯度，從而迫使脂肪酸被動(dòng)擴(kuò)散至胞外，同時(shí)也緩解了脂肪酸在胞內(nèi)累積對(duì)脂肪酸合成所造成的反饋抑制，進(jìn)一步加速脂肪酸合成效率.因此可以認(rèn)為，細(xì)胞膜支架對(duì)于細(xì)胞內(nèi)合成終產(chǎn)物的分泌具有一定的促進(jìn)作用，有助于進(jìn)一步降低生物燃料的生產(chǎn)成本.

特別值得一提的是，基于同樣的策略，文獻(xiàn)[28]在集胞藻PCC6803中構(gòu)建了另外一種細(xì)胞膜支架，從而將胞外游離脂肪酸的產(chǎn)量提高了近8倍(與野生型集胞藻相比，見圖5)，并且提高了突變?cè)逯陮?duì)脂肪酸的耐受能力，由此再一次驗(yàn)證了細(xì)胞膜支架在微生物代謝網(wǎng)絡(luò)改造和優(yōu)化中具有良好的應(yīng)用潛力.

圖5 改造后的集胞藻發(fā)酵液表面漂浮著大量脂肪酸油滴Fig.5 Substantial droplets appeared on the surface of engineered Synechocystis broth

3 光控CRISPRi系統(tǒng)——在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)內(nèi)源基因的精確調(diào)控

研究人員對(duì)基因表達(dá)模式進(jìn)行重編程的方式已經(jīng)發(fā)展到序列特異性基因靶向技術(shù)，包括RNA干擾(RNAi)、鋅指調(diào)控子、轉(zhuǎn)錄激活型效應(yīng)因子(TALE)和CRISPR介導(dǎo)的調(diào)控.在這些技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用中如果對(duì)精確度的要求很高，例如藥物治療，則其調(diào)控效能必須在數(shù)量上可調(diào).盡管已經(jīng)有一些分子開關(guān)能夠成功地開啟或關(guān)閉調(diào)控[29-30]，但仍然缺少可以精確定量調(diào)節(jié)的方法.為此，調(diào)控過程必須在一些實(shí)時(shí)信號(hào)的引導(dǎo)下進(jìn)行.由于光在空間和時(shí)間尺度上都具有較高的分辨率，并且能在極短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生，所以對(duì)于分子生物學(xué)操作而言，它非常方便，同時(shí)對(duì)于需要高通量技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用光是唯一可行的信號(hào).在本文研究中，選取一種合成的藍(lán)光感受器YF1-FixJ-PFixK2作為感應(yīng)外界藍(lán)光信號(hào)的元件[31].CRISPR干擾(CRISPRi)是一種基因組調(diào)控工具[32]，由兩個(gè)基本元件組成：一個(gè)是突變的 II 型CRISPR/Cas系統(tǒng)中的dCas9蛋白，其缺少內(nèi)切酶活性；另一個(gè)是長(zhǎng)度為108 nt的向?qū)NA序列(gRNA)，其中包含了一個(gè)20 nt的堿基配對(duì)區(qū)來決定其對(duì)靶向基因的序列特異性.dCas9∶gRNA復(fù)合物結(jié)合在目標(biāo)基因上并阻擋轉(zhuǎn)錄必需的RNA聚合酶.gRNA介導(dǎo)的干擾在設(shè)計(jì)上成本較低，而且沒有組織特異性，使用起來非常方便.因此，本文將藍(lán)光感受器與CRISRPi相結(jié)合，在大腸桿菌中開發(fā)了一種可以受藍(lán)光控制的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)，用來定量地調(diào)控外源轉(zhuǎn)入的載體基因和宿主內(nèi)源基因的表達(dá)[33].

3.1 利用光強(qiáng)對(duì)質(zhì)粒上整合的報(bào)告基因進(jìn)行定量 調(diào)控

藍(lán)光感受器-CRISPRi系統(tǒng)的構(gòu)建如圖6所示：藍(lán)光感受器由yf1和fixJ構(gòu)成；啟動(dòng)子PFixK2控制gRNA的轉(zhuǎn)錄，gRNA引導(dǎo)dCas9蛋白結(jié)合在目標(biāo)基因的識(shí)別位點(diǎn)，阻止轉(zhuǎn)錄的發(fā)生.YF1是一種藍(lán)光敏感的組氨酸激酶，在沒有藍(lán)光的情況下，YF1磷酸化它的同源響應(yīng)調(diào)控子FixJ，進(jìn)而激活啟動(dòng)子PFixK2.將gRNA放置于PFixK2的下游，因此gRNA的轉(zhuǎn)錄受到藍(lán)光的調(diào)控.理論上，當(dāng)藍(lán)光變強(qiáng)時(shí)，啟動(dòng)子受到抑制，從而減弱gRNA的表達(dá)，CRISPRi對(duì)目標(biāo)基因的抑制效果也將減弱.首先用一種可見的紅色熒光蛋白mrfp作為報(bào)告基因檢測(cè)該調(diào)控系統(tǒng)的功能，并設(shè)計(jì)一個(gè)能特異性靶向結(jié)合mrfp的gRNA.在藍(lán)光感受器YF1-FixJ-PFixK2的響應(yīng)范圍內(nèi)設(shè)置以10個(gè)光強(qiáng)為一個(gè)梯度的從0到飽和的光照強(qiáng)度.為了避免不同實(shí)驗(yàn)組之間由于菌體生長(zhǎng)情況不同所造成的差異，在黑暗中將菌株培養(yǎng)至穩(wěn)定期(OD600=2.2)之后再分成不同的實(shí)驗(yàn)組，在不同光強(qiáng)下繼續(xù)培養(yǎng)15 h后，收集細(xì)胞對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè).結(jié)果顯示：mRFP熒光強(qiáng)度的增長(zhǎng)和光強(qiáng)呈明顯的正相關(guān)關(guān)系，隨著光強(qiáng)的增加，mRFP蛋白的表達(dá)量也逐漸增加.對(duì)不同光強(qiáng)條件下的mRFP熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量測(cè)定，由圖7可見：100%光強(qiáng)時(shí)的mRFP表達(dá)量大約是無光信號(hào)時(shí)mRFP表達(dá)量的2倍；不同光強(qiáng)條件下mRFP表達(dá)菌株的表型變化為光強(qiáng)越大，紅色越深.

圖6 藍(lán)光感受器-CRISPRi系統(tǒng)構(gòu)建示意圖Fig.6 The schematic diagram of Blue sensor-CRISPRi system

圖7 mRFP表達(dá)量與光強(qiáng)的關(guān)系Fig.7 The relationship between mRFP expression and light intensity

3.2 利用光強(qiáng)調(diào)控基因組上內(nèi)源基因的表達(dá)

與轉(zhuǎn)入質(zhì)粒中進(jìn)行表達(dá)的基因不同，基因組上的內(nèi)源基因通常是單拷貝的，對(duì)它們?cè)谵D(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行調(diào)控的方法有所不同.因此，選擇大腸桿菌脂肪酸合成途徑中的一種關(guān)鍵蛋白?；o酶A合成酶FadD作為研究對(duì)象，嘗試用藍(lán)光感受器-CRISPRi系統(tǒng)調(diào)控fadD基因的表達(dá).利用反向PCR的方法替換gRNA中20 nt的堿基互補(bǔ)區(qū)域，使CRISPRi能夠特異性地靶向fadD.同樣，在黑暗中將菌株培養(yǎng)至穩(wěn)定期(OD600=2.0)，然后分成不同的實(shí)驗(yàn)組.在不同光強(qiáng)下培養(yǎng)15 h后，細(xì)胞被收集用來提取RNA.用實(shí)時(shí)定量PCR來對(duì)fadD的mRNA豐度進(jìn)行測(cè)定，以此表征fadD的轉(zhuǎn)錄水平.大腸桿菌的看家基因gapA作為內(nèi)參基因，野生型菌株BL21(DE3)被用來進(jìn)行相對(duì)定量，fadD的mRNA含量隨著藍(lán)光光強(qiáng)的增加有一個(gè)持續(xù)而穩(wěn)定的上升趨勢(shì)(見圖8)，回歸分析[33]R2=0.924.結(jié)果表明：通過用藍(lán)光感受器控制CRISPRi/dCas9系統(tǒng)，能夠?qū)⒛繕?biāo)基因的表達(dá)量與光信號(hào)形成一種量化的對(duì)應(yīng)關(guān)系.因此，光控CRISPRi系統(tǒng)能夠?qū)?nèi)源基因進(jìn)行精確調(diào)控，在代謝途徑優(yōu)化和藥物治療等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用潛力.

圖8 fadD轉(zhuǎn)錄水平和光強(qiáng)的關(guān)系Fig.8 The relationship between the transcriptional level of fadD and light intensity

4 結(jié)語

本文對(duì)3種基因調(diào)控元件的構(gòu)建和應(yīng)用進(jìn)行了詳細(xì)闡述.這些研究緊扣合成生物學(xué)核心思想，獨(dú)辟蹊徑地選擇稀有密碼子和細(xì)胞膜這兩種生物體內(nèi)源基礎(chǔ)的分子元件，并將當(dāng)前廣泛應(yīng)用的CRISPRi/dCas9基因調(diào)控系統(tǒng)與光信號(hào)巧妙結(jié)合，搭建出一種易于操作的高敏感度的反式調(diào)控元件——稀有密碼子開關(guān)，一種兼具穩(wěn)定性和靈活性的內(nèi)源分子支架——細(xì)胞膜支架，以及一種用電腦控制的藍(lán)光信號(hào)精確調(diào)控內(nèi)源基因表達(dá)的調(diào)控工具——光控CRISPRi系統(tǒng).這3種構(gòu)想的實(shí)現(xiàn)為大腸桿菌的基因工程操作和代謝工程研究提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持，不僅能用于可再生生物燃料前體脂肪酸的制備，而且可以廣泛應(yīng)用于其他具有高附加值化學(xué)物品的生物合成和人工生物系統(tǒng)的構(gòu)建.