(美霖佳生物醫(yī)學(xué)科技(蘇州)有限公司,江蘇蘇州 215000)

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸(Angelicasinensis(Oliv.)Diels)的干燥根,性甘、辛、溫,具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止血、潤(rùn)腸通便等保健功效[1]。當(dāng)歸中分離鑒定到的化合物主要包括揮發(fā)油、有機(jī)酸、多糖和黃酮等成分[2],蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等多種氨基酸,以及銅、鐵、錳、鋅等多種微量元素[3],此外,還含有尿嘧啶、腺嘌呤、維生素E、青霉菌屬的代謝產(chǎn)物,以及香豆素類(lèi)等物質(zhì)[4]。這些有效成分對(duì)機(jī)體血液、免疫、神經(jīng)、循環(huán)、呼吸等系統(tǒng)均有較強(qiáng)的藥理作用,同時(shí)具有一定的抗腫瘤、抗氧化、抗炎等作用[5]。當(dāng)歸增強(qiáng)免疫力的功效成分研究主要集中在當(dāng)歸多糖、阿魏酸和以當(dāng)歸內(nèi)酯。楊軼虹等[6]研究表明,當(dāng)歸多糖能增強(qiáng)正常及免疫抑制小鼠的非特異性免疫功能,而對(duì)正常小鼠的體液免疫功能有抑制作用;高向東等[7]的研究表明當(dāng)歸中的阿魏酸對(duì)非特異性免疫、體液免疫和細(xì)胞免疫功能均有較強(qiáng)的促進(jìn)作用;龍銳[8]的研究表明當(dāng)歸內(nèi)酯具有免疫調(diào)解作用和抗腫瘤活性。

當(dāng)歸產(chǎn)品能否有效增強(qiáng)免疫力與其多糖、阿魏酸和以及當(dāng)歸內(nèi)酯三個(gè)功效成分的含量有密切關(guān)系。自制當(dāng)歸膠囊是當(dāng)歸經(jīng)過(guò)優(yōu)化后的提取工藝提取,得到當(dāng)歸醇提物、當(dāng)歸水提物并配以麥芽糊精制粒填充膠囊而組成。當(dāng)歸醇提物中,主要含有當(dāng)歸內(nèi)酯、有機(jī)酸;當(dāng)歸水提物中,主要為多糖。當(dāng)歸內(nèi)酯主要包括藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯、丁烯基酞內(nèi)酯、以及苯酞類(lèi)二聚體,其中以藁本內(nèi)酯含量最高[9];有機(jī)酸有多種,代表為阿魏酸,還有丁二酸、煙酸、十六烷羧酸、香莢蘭酸、鄰二苯酸、茴香酸、壬二酸、棕櫚酸、亞油酸、硬脂酸等酸性成分[10];當(dāng)歸水提物中,當(dāng)歸多糖主含量為15%。所以,藁本內(nèi)酯、阿魏酸、粗多糖可選做為自制當(dāng)歸膠囊的質(zhì)量控制指標(biāo)。藁本內(nèi)酯和阿魏酸的檢測(cè)方法有多種,且多用于當(dāng)歸和當(dāng)歸浸膏的檢測(cè),少見(jiàn)用于制劑成品;粗多糖的檢測(cè)方法有苯酚-硫酸分光光度法、蒽酮-硫酸分光光度法、堿性酒石酸銅滴定法,且不同方法間的檢測(cè)結(jié)果具有一定的差異。故建立適合的藁本內(nèi)酯、阿魏酸、粗多糖含量的測(cè)定方法,確保含量檢測(cè)的準(zhǔn)確性,對(duì)嚴(yán)控自制當(dāng)歸膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有意義。

本文主要建立當(dāng)歸膠囊中三種有效成分藁本內(nèi)酯、阿魏酸、粗多糖含量測(cè)定的方法,并通過(guò)對(duì)三項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)方法進(jìn)行系統(tǒng)適應(yīng)性、專(zhuān)屬性、線性、檢出限、準(zhǔn)確度、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性的方法學(xué)驗(yàn)證,以確定三個(gè)成分檢測(cè)方法的可行性,為當(dāng)歸膠囊制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

當(dāng)歸(171103) 甘肅岷歸中藥材科技有限公司;麥芽糊精 山東保齡寶公司;藁本內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品 純度≥99.8%,上海安譜公司;阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)食品藥品檢定研究院,純度≥99.6%;D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品 純度≥99.9%,中國(guó)食品藥品檢定研究院;甲醇、乙腈 美國(guó)Fisher公司,色譜純;磷酸 分析純,阿拉丁公司;乙醇、硫酸、苯酚 上海凌峰化學(xué),分析純;糖化酶 阿拉丁公司;超純水 自制。

WBT-5半自動(dòng)膠囊填充機(jī) 廣州嘉成制藥設(shè)備;JA2003電子天平 上海舜宇恒平儀器;HH-S6恒溫水浴鍋 常州國(guó)宇儀器;KQ-300DE超聲波清洗器 昆山超聲儀器公司;QL-861漩渦混合器 海門(mén)其林貝爾儀器;ST-16R離心機(jī) Thermo公司;Cary 50紫外分光光度計(jì) Vivian;Lambda 25紫外分光光度計(jì) Perkin Elmer;LC-20AT高效液相色譜儀、LC-20AD高效液相色譜儀 島津;Hypersil GOLD C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm) Thermo。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 當(dāng)歸膠囊的制備 經(jīng)過(guò)前期的工藝研究,當(dāng)歸膠囊制備工藝為:當(dāng)歸粉碎,過(guò)篩,得當(dāng)歸粗粉,加入80%乙醇,最佳醇提工藝(提取次數(shù)2次,醇濃度為80%,提取溫度85 ℃,料液比為8∶1,每次提取時(shí)間為2 h)下提取得醇提液,醇提液濃縮、真空干燥得到當(dāng)歸醇提物;醇提后的藥渣再用水(提取次數(shù)3次,提取溫度100 ℃,料液比為9∶1,每次提取時(shí)間為1 h)加熱提取得水提液,水提液濃縮、真空干燥得到當(dāng)歸水提物。將上述當(dāng)歸醇提物、當(dāng)歸水提物輔以麥芽糊精按照4∶1∶6比例混勻,加入90%的乙醇制粒,干燥,得到干燥顆粒,將干燥顆粒放入膠囊填充機(jī)中,填充為0.3 g/粒膠囊,即得當(dāng)歸膠囊。

1.2.2 成分檢測(cè)方法

1.2.2.1 藁本內(nèi)酯的測(cè)定 方法參考《WM/T 4-2004 當(dāng)歸提取物》[11]而制定。

a.供試品溶液的制備:稱(chēng)取當(dāng)歸膠囊內(nèi)容物0.5 g,置于50 mL棕色容量瓶中,加入5 mL超純水,搖勻,使固形物全部溶解呈乳白色溶液,然后加入約40 mL甲醇溶液,超聲處理10 min后取出,放置至室溫,加入甲醇溶液至刻度,搖勻,用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾于棕色試樣瓶中,即得。

b.對(duì)照品溶液的制備:取藁本內(nèi)酯對(duì)照品,精密稱(chēng)定20 mg,置50 mL棕色量瓶中,加甲醇定容,制成每1 mL含400 μg對(duì)照品儲(chǔ)備液(即:400 μg/mL),搖勻,精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液2.5 mL置25 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得40 μg/mL藁本內(nèi)酯對(duì)照品溶液,備用。

c.樣品測(cè)定:分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL,注入液相色譜儀,測(cè)定,即得。

d.色譜條件:流動(dòng)相:A相:甲醇,B相:超純水;檢測(cè)波長(zhǎng):320 nm;柱溫:30 ℃;流速:0.8 mL/min;洗脫方式:梯度洗脫,20 min內(nèi)A相由40%線性變化為100%;進(jìn)樣量:10 μL;稀釋劑:甲醇。

1.2.2.2 阿魏酸的測(cè)定 方法參考《中華人民共和國(guó)藥典(2015版一部)》[1]“當(dāng)歸 含量測(cè)定 阿魏酸”而制定。

a.供試品溶液的制備:稱(chēng)取當(dāng)歸膠囊內(nèi)容物0.4 g,置于25 mL棕色容量瓶中,加入70%甲醇20 mL,超聲處理10 min后取出,放置至室溫,加入70%甲醇至刻度,搖勻,用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾于棕色試樣瓶中,即得。

b.對(duì)照品溶液的制備:取阿魏酸對(duì)照品,精密稱(chēng)定10 mg,置25 mL棕色量瓶中,加70%甲醇定容,制成每1 mL含400 μg對(duì)照品母儲(chǔ)備液(即:400 μg/mL),搖勻,精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液2.5 mL置25 mL量瓶中,加70%甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得40 μg/mL阿魏酸對(duì)照品溶液,備用。

c.樣品測(cè)定:分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL,注入液相色譜儀,測(cè)定,即得。

d.色譜條件:流動(dòng)相:乙腈-0.085%磷酸溶液(17∶83);檢測(cè)波長(zhǎng):316 nm;柱溫:35 ℃;流速:0.8 mL/min;洗脫方式:等度洗脫;樣量:10 μL;稀釋劑:70%甲醇。

1.2.2.3 粗多糖的測(cè)定 方法參考白鴻主編的《保健食品功效成分檢測(cè)方法》[12]中“粗多糖的苯酚-硫酸分光光度測(cè)定法”而制定。

a.供試品溶液的制備:稱(chēng)取當(dāng)歸膠囊內(nèi)容物2.0 g,置于容量瓶中,加入純化水,于沸水浴中加熱15 min,冷卻至60 ℃以下,加入1 mL糖化酶,于55 ℃,酶解60 min,完成后于電爐上加熱至沸(滅酶),冷卻,定容,混勻后過(guò)濾,棄初濾液,收集余下濾液。吸取部分濾液于具塞離心管中,加入無(wú)水乙醇,混勻,醇沉,靜置過(guò)夜,離心棄去上清液,殘?jiān)?0%乙醇溶液數(shù)毫升洗滌,離心后棄去上清液,反復(fù)操作3次。殘?jiān)眉兓芙獠⒍ㄈ?即可。

b.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:準(zhǔn)確吸取葡萄糖使用液0、0.25、0.375、0.50、0.625、0.75、1.0 mL(相當(dāng)于葡萄糖0、0.05、0.075、0.10、0.125、0.15、0.20 mg)置于25 mL比色管中,補(bǔ)加水至2.0 mL,加1.0 mL的5%苯酚溶液混勻。小心加入濃硫酸10 mL,小心混勻,置沸水浴中20 min,冷卻至室溫,用分光光度計(jì)在480 nm波長(zhǎng)處試劑空白為參比,1 cm比色皿測(cè)定吸光度值。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

c.對(duì)照品溶液的制備:準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥恒重的D-無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品500 mg加水溶解,并定容至50 mL,此溶液1 mL含10 mg葡萄糖(10 mg/mL),用前稀釋50倍為葡萄糖使用液(0.2 mg/mL),備用。

d.樣品測(cè)定:準(zhǔn)確吸取上液適量置于25 mL比色管中,補(bǔ)加水至2.0 mL,然后按上述法測(cè)定吸光度值。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出葡萄糖含量,計(jì)算樣品中粗多糖含量。

1.2.3 方法學(xué)驗(yàn)證 對(duì)當(dāng)歸膠囊中有效成分藁本內(nèi)酯、阿魏酸、粗多糖含量測(cè)定的方法,進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。藁本內(nèi)酯[13]、阿魏酸[14-15]采用高效液相色譜法含量測(cè)定,并進(jìn)行方法學(xué)考察,包括系統(tǒng)適應(yīng)性、專(zhuān)屬性、線性、檢出限、準(zhǔn)確度、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性等[16-17];粗多糖采用紫外分光光度法[18],并進(jìn)行方法學(xué)考察,包括專(zhuān)屬性、線性、檢出限、準(zhǔn)確度、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性等[19-20]。具體方法學(xué)考察項(xiàng)目見(jiàn)表1[21-22]。

表1 藁本內(nèi)酯、阿魏酸、粗多糖含量測(cè)定的方法學(xué)考察項(xiàng)目安排Table 1 Project arrangement of method validation on the determination of ligustilide,ferulic acid and polysaccharide

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性

分別按照1.2.2.1、1.2.2.2對(duì)照品溶液制備方法制備對(duì)照品溶液,各自連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄色譜圖,查看理論塔板數(shù),見(jiàn)表2,結(jié)果表明:理論板數(shù)均遠(yuǎn)大于5000,藁本內(nèi)酯、阿魏酸含量測(cè)定的系統(tǒng)適應(yīng)性良好。

表2 藁本內(nèi)酯、阿魏酸含量測(cè)定系統(tǒng)適應(yīng)性結(jié)果Table 2 System adaptability results of the determination of ligustilide and ferulic acid

2.2 專(zhuān)屬性

藁本內(nèi)酯專(zhuān)屬性:將空白溶液(甲醇)、陰性樣品(麥芽糊精)、對(duì)照品溶液、供試品溶液,分別進(jìn)樣,記錄色譜圖,見(jiàn)圖1。結(jié)果表明:供試品與對(duì)照品的藁本內(nèi)酯色譜峰位置一致,陰性和試劑空白在相應(yīng)保留時(shí)間處不顯示色譜峰,供試品目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰能夠完全分離,分離度(Resolution)R>1.5,表明該方法專(zhuān)屬性良好。

圖1 藁本內(nèi)酯含量測(cè)定專(zhuān)屬性結(jié)果Fig.1 Exclusivity results of the determination of ligustilide注：a：空白；b：陰性樣品；c：對(duì)照品；d：供試品。

阿魏酸專(zhuān)屬性:將空白溶液(70%甲醇)、陰性樣品(麥芽糊精)、對(duì)照品溶液、供試品溶液,分別進(jìn)樣,記錄色譜圖,見(jiàn)圖2。結(jié)果表明:供試品與對(duì)照品的阿魏酸色譜峰位置一致,陰性和試劑空白在相應(yīng)保留時(shí)間處不顯示色譜峰,目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰能夠完全分離,R>1.5,表明該方法專(zhuān)屬性良好。

圖2 阿魏酸含量測(cè)定專(zhuān)屬性結(jié)果Fig.2 Exclusivity results of the determination of ferulic acid注：a：空白；b：陰性樣品；c：對(duì)照品；d：供試品。

粗多糖專(zhuān)屬性:將試劑空白、陰性樣品(麥芽糊精)、對(duì)照品溶液、供試品溶液,分別進(jìn)樣,記錄400～600 nm掃描圖,見(jiàn)圖3。結(jié)果表明:陰性樣品和試劑空白,在480 nm處無(wú)吸收峰;供試品溶液和對(duì)照品溶液在480 nm,均有吸收峰,表明該方法專(zhuān)屬性良好。

圖3 粗多糖含量測(cè)定專(zhuān)屬性結(jié)果Fig.3 Exclusivity results of the determination of polysaccharide注：a：空白；b：陰性樣品；c：對(duì)照品；d：供試品。

2.3 線性考察

藁本內(nèi)酯:精密量取400 μg/mL藁本內(nèi)酯對(duì)照品溶液0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mL,并稀釋至10 mL,配制成相對(duì)濃度為50%、75%、100%、125%、150%的對(duì)照品溶液。取上述對(duì)照品溶液,分別進(jìn)樣,記錄色譜圖,以測(cè)得的色譜峰峰面積對(duì)濃度作圖,計(jì)算線性回歸方程及相關(guān)系數(shù),結(jié)果見(jiàn)表3。

阿魏酸:精密量取40 μg/mL阿魏酸對(duì)照品溶液1.5、2.25、3.0、3.75、4.5 mL,并稀釋至10 mL,配制成相對(duì)濃度為50%、75%、100%、125%、150%的對(duì)照品溶液。取上述對(duì)照品溶液,分別進(jìn)樣,記錄色譜圖,以測(cè)得的色譜峰峰面積對(duì)濃度作圖,計(jì)算線性回歸方程及相關(guān)系數(shù),結(jié)果見(jiàn)表3。

粗多糖:按照1.2.2.3步驟,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算線性回歸方程及相關(guān)系數(shù),結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 藁本內(nèi)酯、阿魏酸、粗多糖含量測(cè)定線性關(guān)系和檢出限考察結(jié)果Table 3 Linearity and detection limit results of the determination of ligustilide,ferulic acid and polysaccharide

從線性考察可知,藁本內(nèi)酯、阿魏酸的線性回歸方程相關(guān)系數(shù)分別為0.9996和0.9990,符合表1中藁本內(nèi)酯、阿魏酸相關(guān)系數(shù)≥0.999的要求,粗多糖的線性回歸方程相關(guān)系數(shù)為0.9987,符合表1中粗多糖參數(shù)R≥0.99的要求。由此可見(jiàn),三種檢測(cè)方法在范圍內(nèi)均成良好的線性關(guān)系。

2.4 檢出限

藁本內(nèi)酯:取藁本內(nèi)酯對(duì)照品溶液適量,用稀釋劑逐步稀釋。按照檢測(cè)方法進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算各色譜峰信噪比(S/N),以S/N≥3時(shí)質(zhì)量濃度為檢出限,結(jié)果見(jiàn)表3。

阿魏酸:同藁本內(nèi)酯檢出限方法,結(jié)果見(jiàn)表3。

粗多糖:取20份空白溶液,進(jìn)樣,計(jì)算20次測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差S,按照公式:L=3S/b,計(jì)算,結(jié)果見(jiàn)表3。

2.5 準(zhǔn)確度

取供試品溶液各9份,分別加50%、100%、150%對(duì)照品,配制成加標(biāo)溶液,計(jì)算回收率和RSD,結(jié)果見(jiàn)表4。藁本內(nèi)酯、阿魏酸、粗多糖含量測(cè)定方法的回收率均在90%～110%,RSD≤5%,說(shuō)明三個(gè)含量測(cè)定方法的準(zhǔn)確度均良好。

表4 藁本內(nèi)酯、阿魏酸、粗多糖含量測(cè)定準(zhǔn)確度考察結(jié)果Table 4 Accuracy results of the determination of ligustilide,ferulic acid and polysaccharide

2.6 精密度

藁本內(nèi)酯:同一對(duì)照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6 次,測(cè)定峰面積,計(jì)算RSD,結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 藁本內(nèi)酯、阿魏酸、粗多糖含量測(cè)定精密度考察結(jié)果Table 5 Precision results of the determination of ligustilide,ferulic acid and polysaccharide

阿魏酸:同藁本內(nèi)酯精密度考察方法,結(jié)果見(jiàn)表5。

粗多糖:同一對(duì)照品溶液,測(cè)定6次吸光度,計(jì)算RSD,結(jié)果見(jiàn)表5。

藁本內(nèi)酯、阿魏酸、粗多糖含量測(cè)定方法的精密度RSD≤5%,說(shuō)明三個(gè)含量測(cè)定方法的精密度均良好。

2.7 重復(fù)性

藁本內(nèi)酯:取當(dāng)歸膠囊樣品(20180711)6份,制成供試品溶液,進(jìn)樣,測(cè)定,計(jì)算藁本內(nèi)酯含量,計(jì)算RSD,結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 藁本內(nèi)酯、阿魏酸、粗多糖含量測(cè)定重復(fù)性考察結(jié)果Table 6 Repeatability results of the determination of ligustilide,ferulic acid and polysaccharide

阿魏酸:同藁本內(nèi)酯重復(fù)性考察方法,結(jié)果見(jiàn)表6。

粗多糖:同藁本內(nèi)酯重復(fù)性考察方法,結(jié)果見(jiàn)表6。

藁本內(nèi)酯、阿魏酸、粗多糖含量測(cè)定方法的重復(fù)性RSD≤5%,說(shuō)明三個(gè)含量測(cè)定方法的重復(fù)性均良好。

2.8 穩(wěn)定性

藁本內(nèi)酯:取供試品溶液,于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣,觀察峰面積變化,并計(jì)算峰面積的RSD,結(jié)果見(jiàn)表7。

阿魏酸:同藁本內(nèi)酯穩(wěn)定性考察方法,結(jié)果見(jiàn)表7。

粗多糖:同藁本內(nèi)酯穩(wěn)定性方法,觀察吸光值變化,計(jì)算吸光值的RSD,結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 藁本內(nèi)酯、阿魏酸、粗多糖含量測(cè)定穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 7 Stability results of the determination of ligustilide,ferulic acid and polysaccharide

結(jié)果可見(jiàn),三個(gè)方法的穩(wěn)定性RSD≤5%,說(shuō)明三個(gè)含量測(cè)定方法的穩(wěn)定性均良好。

3 結(jié)論

本研究依據(jù)當(dāng)歸膠囊的組方特性,選擇藁本內(nèi)酯、阿魏酸、粗多糖為標(biāo)志性成分,建立了當(dāng)歸膠囊三個(gè)組分含量測(cè)定的方法。藁本內(nèi)酯、阿魏酸采用液相色譜法,粗多糖采用紫外分光光度法,通過(guò)對(duì)系統(tǒng)適用性、專(zhuān)屬性、線性、檢出限、準(zhǔn)確度、精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性等指標(biāo)的考察,證明當(dāng)歸膠囊中藁本內(nèi)酯、阿魏酸、粗多糖含量測(cè)定的方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠。